Metoda wysokoprzepustowa do obserwacji fenotypów ruchliwości u Pseudomonas aeruginosa

Nasze badania koncentrują się na zrozumieniu działania bakterii i wywoływania infekcji z wykorzystaniem biologii systemowej i genomiki. Naszym celem jest identyfikacja genów wpływających na fizjologię bakterii w warunkach naśladujących środowisko zakażenia, aby znaleźć nowe cele do opracowania lepszych antybiotyków i alternatywnych terapii. Opracowaliśmy protokół o wysokiej przepustowości do identyfikacji czynników genetycznych wpływających na ruchliwość Pseudomonas aeruginosa, umożliwiając analizę zachowań rojowych i drgawających na całym genomie. Inicjatywa badawcza odkryła molekularne mechanizmy napędzające ruchliwość, które również przyczyniają się do powstawania biofilmu, kolonizacji i unikania obrony gospodarza.

Jest adaptowalny do różnych testów i gatunków bakterii. Na początek weź płyty źródłowe z biblioteki mutantów transpozonów Pseudomonas aeruginosa i pozostawij je na powierzchni w temperaturze pokojowej na około godzinę, aby ostygły. Do pożądanego testu wybierz płytki M9 z glukozą 0,5% agar do rojowania oraz płytki LB agar 1% do drgania.

Aby skonfigurować replikator do dokładnego transferu kolonii, włącz replikator. W sekcji wybierz i tryb działania wybierz wybierz i uruchom zapisane programy. W sekcji wybierz płyty źródłowe, wybierz plus płyta 384 agar.

Następnie, w sekcji wyboru tarczy docelowej, wybierz plus płyta 384 agar. W sekcji wybierz pady, wybierz krótki pin 384. W programach singer wybierz replikuj wiele, następnie przejdź do opcji replikacji programów i wybierz ogólne, recykluj i brak.

W źródle sekcji wybierz przesunięcie, następnie losowy i domyślny promień. W sekcji docelowej wybierz przypinanie i dostosuj ciśnienie do 2%. Wszystkie pozostałe ustawienia zostaw domyślnie. Następnie włóż krótki pin RePads 384 do odpowiedniej komory.

Umieść płytkę źródłową i celu na wyznaczonej platformie replikatora. Umieść płytki źródłowe o gęstości 384 oraz puste płytki motoryczności na platformie. Naciśnij run z wybranymi parametrami, aby rozpocząć proces transferu.

Robot do przypinania mikrobiologicznych tablic przenosi kolonie z płyt źródłowych o gęstości 384 na płytki ruchliwości. Następnie umieść zaszczepione płytki motoryki do plastikowych worków. Ostrożnie umieść worki z płytkami do inkubatora, ustawionego na 37 stopni Celsjusza przez 18 godzin.

Po okresie inkubacji wykonuj obrazy płyt ruchliwości o wysokiej rozdzielczości za pomocą dowolnego wysokiej jakości oprogramowania do obrazowania. Po wykonaniu testu motoryki i obrazowaniu płytek motorycznych, uruchom makro w ImageJ. Otwórz folder zawierający obrazy, aby załadować partię do analizy.

Po zapytanie zmodyfikuj kąt za pomocą opcji podglądu, aż płytka będzie prosta, aby dostosować jej obrót. Gdy będziesz zadowolony, kliknij przycisk ok. Następnie przesuwaj narzędzie prostokątne wokół kolonii, aby przyciąć część płyty zawierającą kolonie.

Gdy będziesz gotowy, kliknij OK, aby zakończyć przycinanie. Zdefiniuj siatkę użytą do narysowania obszaru zainteresowania, czyli ROI, wokół każdej kolonii i zmierz powierzchnię ruchliwości. Wybierz odpowiednią gęstość kolonii i dostosuj parametry w razie potrzeby, aby każdy okrąg znalazł się wokół jednej z nich.

Gdy będziesz gotowy, aktywuj pole "ok" i kliknij przycisk "ok". Obszar ruchliwości każdej kolonii zostanie zmierzony, a plik CSV zawierający dane zostanie zapisany w wyznaczonym folderze. Do testu ruchliwości należy podłożyć roztwór agaru zawierający M9, glukozę, kwasy kazaminowe i siarczan magnezu.

Wlej 25 mililitrów schłodzonego, wymieszanego agaru do każdej płytki Petriego. Następnie zaszczep każdą płytkę 2,5 mikrolitra nocnej hodowli bakteryjnej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 godzin, z pokrywami skierowanymi do góry, aby obserwować fenotypy ruchliwości. Po autoklawowaniu roztworu LB z 1% agarem wlej 25 mililitrów schłodzonego, wymieszanego LB 1%agaru na płytki Petriego.

Zakłuj bakterie na dnie drgających płytek zawierających 1% agaru. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin, a następnie w temperaturze pokojowej przez kolejne 48 godzin. Po inkubacji ostrożnie usuń agar z płytek.

Zwizualizuj strefę drgania, barwiąc szalkę Petriego roztworem fioletu o stężeniu 1%. Test ruchliwości drgającej wykazał, że mutanci Pseudomonas aeruginosa z delecją genów w maszynie T4P wykazywali znacząco mniejsze obszary halo w porównaniu do typu dzikiego, co wskazuje na zmniejszoną ruchliwość drgawk. Analiza ruchliwości rojów wykazała, że mutanci delecyjni z biblioteki PA14 miały znacząco zmniejszone obszary halo bez wypustek, co potwierdza wadliwą zdolność rojowań.

Badania ruchliwości bakteryjnej często są ograniczone przez przepustowość. Nasz protokół wysokoprzepustowej motorykości pomoże naukowcom kompleksowo badać ruchliwość bakteryjną. Na przykład, korzystając z kolekcji mutantów obejmującej cały genom, możliwe staje się zidentyfikowanie wszystkich genów powiązanych z ruchliwością i ujawnienie, jak bakterie powodują infekcje.

Nasze wyniki rodzą nowe pytania dotyczące genetycznej kontroli ruchliwości u Pseudomonas aeruginosa, jej roli w tworzeniu biofilmu oraz związku z patogenezą. Pomagają także w badaniu, jak warunki środowiskowe kształtują zachowania motorykalne oraz czy celowanie w geny motoryki może prowadzić do powstania innowacyjnych terapii przeciwdrobnoustrojowych.