System podwójnej ekspresji oparty na komplementacji GFP do oceny kontaktu komórka-komórka, w którym pośredniczą cytonemy w żywych krążkach imaginalnych skrzydeł Drosophila

Dlatego nasze badania koncentrują się na zrozumieniu, w jaki sposób komórki w tkankach oddalone od siebie komunikują się ze sobą. Używamy dysku imaginalnego skrzydła Drosophila jako systemu modelowego, aby spróbować zrozumieć, jak powstaje cytydyna, jak funkcjonuje i jaką rolę odgrywa w lokalnym kontrolowaniu wzrostu tkanek. Badania sugerują, że czynniki wzrostu często przemieszczają się przez wyspecjalizowane projekcje komórkowe, takie jak filopodia sygnalizacyjne oparte na aktynie, zwane cytonemami, aby zostać dostarczone do komórek docelowych.

Cytonemy to bardzo cienkie i delikatne struktury, które łatwo ulegają zakłóceniu za pomocą protokołu fiksacji. Aby je zaobserwować, należy użyć dedykowanych metod obrazowania na żywo z ekspresyjnym białkiem znakowanym fluorescencyjnie. To znacznie ogranicza narzędzia i podejścia, których możemy użyć do ich zbadania.

Zidentyfikowaliśmy kinazę białkową o nazwie Slik, która bierze udział w biogenezie cytonemu. Ekspresja Slik w jednej warstwie zewnątrzoponowej w krążku imaginalnym skrzydła wyzwala tworzenie cytonemu, który przenika przez światło dysku i stymuluje proliferację komórek w sąsiedniej warstwie nabłonkowej. W przyszłości chcielibyśmy zidentyfikować białko działające za Slik w celu promowania tworzenia cytonemu, zidentyfikować ligand, który jest dostarczany przez ten cytonem w celu promowania perforacji oraz lepiej zrozumieć fizjologiczne znaczenie tego mechanizmu w kontrolowaniu wzrostu tkanki.

Na początek wytnij nożyczkami poszczególne dołki z ośmiodołkowego paska, a następnie przetnij każdą studzienkę na pół. Usuń podkład ochronny z jednej strony każdej połówki i przyklej przekładki do szkiełka mikroskopu, lekko je od siebie rozsuwając, aby stworzyć osłoniętą centralną przestrzeń do umieszczenia dysku. Pobrać wędrujące larwy trzeciego stadium rozwojowego z probówki hodowlanej po krzyżowaniu genetycznym i inkubacji w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Pod mikroskopem preparacyjnym przenieś larwy do kropli żywego podłoża obrazowego na pokrytej silikonem szalce Petriego. Używając dwóch kleszczy preparacyjnych, rozpocznij sekcję od uszczypnięcia larw w odległości około 1/3 długości ciała od przodu za pomocą jednej pary kleszczy, aby utrzymać je stabilnie. W przypadku drugiej pary ściśnij ciało tuż za pierwszym punktem i pociągnij, aby oddzielić tylną połowę, izolując przednią część.

Odwróć przednią połowę, chwytając pęsetą po obu stronach odciętego końca i przepychając głowę za pomocą drugiej pary, obracając ją na lewą stronę. Odsłania to struktury wewnętrzne, takie jak dyski wyobrażeniowe, tchawica, gruczoły ślinowe, ciało tłuszczowe i jelita. Usuń gruczoły ślinowe, ciało tłuszczowe i jelita za pomocą kleszczy, uważając, aby nie naruszyć bocznych pni tchawicy pokrywających krążki skrzydeł.

Za pomocą kleszczy przenieś oczyszczone przednie połówki z dołączonymi krążkami skrzydełkowymi do kropli czystego podłoża do obrazowania na żywo za pomocą haczyków umieszczonych między przekładkami szkiełkowymi. Aby odizolować krążki skrzydeł, delikatnie odetnij je od drobnych gałęzi tchawicy za pomocą jednego ostrza kleszczy preparacyjnych lub cienkiego drutu wolframowego zamontowanego na uchwycie igły preparującej. Wyrzuć pozostałą tuszę.

Ustaw tarcze skrzydeł za pomocą ostrza kleszczy preparacyjnych lub igły wolframowej tak, aby strona błony okołopobiernej była skierowana do góry. Dostosuj objętość medium tak, aby nieznacznie przepełniało studnię powyżej poziomu przekładki. Usuń górny spód ochronny z przekładki obrazowania i delikatnie opuść szkiełko nakrywkowe na próbkę.

Dociśnij szkiełko nakrywkowe w punktach styku przekładki za pomocą zaokrąglonego końca kleszczy, aby zapewnić prawidłowe przyleganie. Aby wyświetlić stosy obrazów w ImageJ, wybierz Obraz, następnie Stosy, a następnie Projekcja Z i wybierz z menu opcję Maksymalna intensywność. Na obrazach projekcji maksymalnej intensywności zidentyfikuj obszar torebki skrzydła na podstawie wzoru składania dysku skrzydła za pomocą kanału haków i narzędzia do zaznaczania wielokątów.

Zastosuj to samo zaznaczenie do kanału GFP i wybierz Edytuj, a następnie Wyczyść na zewnątrz, aby wyeliminować szum poza wybranym regionem. Użyj kanału haków na obrazach projekcji o maksymalnej intensywności, aby zidentyfikować artefakty na obrazach GFP. Następnie zaznacz obszar za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów.

Kliknij Edytuj i wybierz Wyczyść. Na oczyszczonych obrazach projekcji o maksymalnej intensywności wybierz opcję Analizuj, a następnie histogram, a następnie wybierz opcję Lista, aby uzyskać wszystkie wartości pikseli. Skopiuj tę listę do tabeli arkusza kalkulacyjnego.

Aby ustawić wartość progową, przeanalizuj sygnał tła w próbkach kontroli ujemnej i potwierdź tę wartość za pomocą innych przykładowych obrazów. Obliczyć procentową zawartość powierzchni dodatniej metodą GFP, dzieląc liczbę pikseli powyżej progu przez całkowitą liczbę prawidłowych pikseli i mnożąc wynik przez 100. Na koniec znormalizuj każdą obliczoną wartość po podzieleniu jej przez średnią warunku odniesienia, który jest ustawiony na jeden.

W dyskach typu dzikiego pozbawionych obu podzielonych składników GFP, w pobliżu środka torebki skrzydłowej zaobserwowano tylko minimalną ziarnistą autofluorescencję GFP, a ten podstawowy sygnał wykorzystano do określenia progu fluorescencji. Dyski wyrażające tylko CD4 split GFP1-10 w warstwie właściwej dysku wykazywały poziomy fluorescencji nie do odróżnienia od typu dzikiego, potwierdzając niefluorescencyjną naturę samego GFP1-10. Jednoczesna ekspresja CD4 rozszczepionego GFP1-10 we właściwym dysku i CD4spGFP11 w błonie okołopodniowej doprowadziła do zauważalnego wzrostu dyskretnych, jasnych plamek GFP zlokalizowanych w świetle dysku, ze znacznie większym dodatnim obszarem fluorescencji powyżej progu niż w grupie kontrolnej.

Ekspresja Slik we właściwym krążku spowodowała silny wzrost gęstości jąder błony okołopodialnej i dramatyczny wzrost intensywności sygnału GFP w całym obszarze torebki skrzydłowej, co sugeruje, że cytonemy indukowane przez Slik nawiązują zwiększony kontakt z komórkami błony okołopodniowej.