Obrazowanie na żywo i charakteryzacja dynamiki mikrogleju oraz interakcji z synapsami w chorej siatkówce myszy
16 stycznia 2026
Niniejszy artykuł demonstruje metodę wizualizacji i ilościowej ruchliwości mikrogleju oraz kontaktu z postsynaptycznymi punktami siatkówki za pomocą obracającej się mikroskopii konfokalnej dysku.
Zakres badań naszego laboratorium polega na zgłębieniu mechanizmów jaskry i mikrogleju w remodelowaniu synaps podczas rozwoju. Obecne wyzwania eksperymentalne dotyczą tego, czy mikroglej aktywnie rozkłada synapsy komórek zwojowe siatkówki, czy tylko biernie usuwa zanieczyszczenia. Zacznij od siatkówki myszy umieszczonej na papierze filtracyjnym i wysusz ją laboratoryjną chusteczką.
Odwróć siatkówkę na szalkę Petriego MatTek. Obciąż siatkówkę metalowymi kulkami lub pierścionem. Następnie dodaj od trzech do pięciu kropli sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego.
Umieść próbkę pod obracającym się mikroskopem konfokalnym i dostosuj ustawienia, aby podglądać siatkówkę. Zbieraj obrazy wzdłuż osi Z na głębokości całkowitej od 10 do 20 mikrometrów, używając kroku 0,3 mikrometra. Utrzymuj odstęp czasu między klatkami na poziomie 20 do 30 sekund, aby umożliwić niezawodne śledzenie komórek.
Aby wykonać renderowanie powierzchni mikroglej, przekonwertuj plik timelapse na format IMS za pomocą oprogramowania do konwertera plików. Wprowadź rozmiary wokseli na podstawie wcześniej nadanych właściwości obrazu. W oprogramowaniu analitycznym kliknij folder obserwowania, aby otworzyć przekonwertowany plik i upewnić się, że obraz jest w widoku 3D.
Aby wykryć pojedynczy mikroglej, kliknij ikonę dodaj nową powierzchnię w pasku narzędzi obiektów. Wybierz segment tylko obszar zainteresowania, śledź powierzchnie w czasie, klasyfikuj powierzchnie oraz statystyki obiekt-obiekt w ustawieniach algorytmu. Następnie kliknij niebieski przycisk play, aby przejść dalej.
Wybierz kanał do renderowania powierzchni. Opcjonalnie włącz wygładzanie, aby wygładzić tworzenie powierzchni i wprowadzić detale powierzchni. W kategorii progowej wybierz segmentację uczenia maszynowego do wykrywania komórek.
W sekcji danych treningowych użyj narzędzi do pędzla do tła i pierwszego planu. Rysuj pociągnięcia pędzla, wybierając wybrany pędzel i używając shifta oraz lewego przycisku myszy. Upewnij się, że wyświetlanie interpolacji jest włączone, następnie wybierz train and predict.
Użyj żółtego wskaźnika na środku, aby nawigować wzdłuż osi Z. Narysuj wiele kresek na płaszczyznach X, Y i Z oraz w kilku przedziałach czasowych. Używaj od trzech do pięciu krótkich pociągów na wpis, iteracyjnie dostosowując powierzchnię, aż uzyskamy dokładną powierzchnię.
Użyj żółtego prostokąta, aby przełączać się między wyświetlaczem treningowym a faktyczną powierzchnią utworzoną jako ostateczny kontrol. Sprawdź też, czy powierzchnia pokrywa się z morfologią komórki. Po zakończeniu odznacz podzielone obiekty.
Dostosuj próg histogramu wokselowego, aby usunąć małe, niepołączone obiekty niebędące częścią powierzchni głównej. Następnie ręcznie edytuj powierzchnię, aby usunąć zbędne obiekty lub wycięte krawędzie za pomocą narzędzia nożycowego. Jeśli chcesz, ustaw próg dozwolonych przerw dla obiektu i wybierz algorytm śledzenia dla poruszającej się komórki.
Filtruj obiekty niezwiązane z główną powierzchnią. Po zakończeniu ustaw wyświetlanie ruchomych komórek na przezroczysty profil, aby zwizualizować punkty dla kolejnych kroków. Aby wykryć pojedyncze punkty PSD95, kliknij na ikonę niebieskiej powierzchni w pasku narzędzi obiektów.
Następnie wybierz miejsca na torze w czasie, sklasyfikuj je oraz statystyki obiekt-obiekt i naciśnij play. Wybierz kanał źródłowy dla markera synaptycznego. Wyłącz slicer i inne kanały, aby wizualizować tylko PSD95.
Użyj przycisku Control oraz narzędzia do wyboru wskaźnika, aby oszacować średnicę XY punkty. Wybierz kilka jasnych punktów, które utrzymują się na wszystkich klatkach i wyłącz odejmowanie tła. Następnie dodaj filtr na podstawie jakości punktu.
Dostosuj histogram, aby uwzględniał dokładne punkty PSD95 we wszystkich przedziałach czasowych. Usuń fałszywie pozytywne miejsca przez edycję. Przełącz kursor sześcianu lub kółka, aby usunąć miejsca trwające tylko jedną lub dwie klatki.
Jeśli chcesz, ustaw próg dozwolonych przerw i wybierz algorytm śledzenia dla plam synaptycznych. Filtruj ślady punktowe niepowiązane z prawdziwymi punktami, używając progu histogramu, aby wykluczyć ślady małych obiektów. Zdefiniuj klasyfikacje na podstawie klasyfikacji najkrótszej odległości do powierzchni.
Otoczony jako każdy punkt poniżej zera mikrometrów, kontaktowany w odległości od zera do 0,5 mikrometra od powierzchni, a niekontaktowany jako 0,5 mikrometra i ponad 0,5 mikrometra. Przypisz etykiety zdarzeniom, korzystając z klasyfikacji, które zostały znalezione powyżej. Gdy powierzchnie i plamy odpowiednio reprezentują mikroglej i punkty, wyeksportuj wszystkie statystyki w zakładce statystyk.
Mikroglej wykazywał wydłużony czas przesunięcia procesu po nadciśnieniu ocznym wywołanym laserem w porównaniu do grupy kontrolnej. Szybkość mikrogleju była istotnie wyższa w oczach leczonych laserowo niż u grup kontrolnych. Liczba zdarzeń kontaktowych między mikroglejem a PSD95 puncta wzrosła po leczeniu laserowym.
Nagrania poklatkowe wykazały, że siatkówki poddane laserowi wykazywały większą ruchliwość mikrogleju oraz zwiększoną interakcję z PSD95 puncta w porównaniu z siatkówkami kontrolnymi. Nasze istotne wyniki wykazały wzrost liczby mikroglejów, złożoności i ruchliwości oraz synaptycznej kolokalizacji po przejściowym podniesieniu ciśnienia wewnątrzgałkowego u myszy. Nasz protokół oferuje obrazowanie ex vivo, co pomaga uniknąć problemów z zaćmą i nieprzezroczystością rogówki, umożliwiając łatwiejsze przygotowanie do szybszych eksperymentów i ogólnie wyższą przepustowość.
Nasze wyniki wspierają badania, umożliwiając wizualizację interakcji mikroglej-neuron, komunikacji komórkowej i dynamiki za pomocą transgenicznych linii fluorescencjowych, a także obrazowania poklatkowego o wysokiej rozdzielczości.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje model eksplantu siatkówki myszy ex vivo do badania dynamiki mikrogleju oraz jego oddziaływań z białkami synaptycznymi. Dzięki zastosowaniu konfokalnej mikroskopii z dyskiem obrotowym oraz zaawansowanej analizy obrazu, metoda ta umożliwia szczegółowe ilościowe określenie ruchliwości mikrogleju i kontaktów synaptycznych zarówno w warunkach homeostazy, jak i po wystąpieniu uszkodzenia. Podejście to jest szczególnie przydatne w badaniu zapośredniczonego przez mikroglej przycinania synaptycznego w modelach chorób neurodegeneracyjnych siatkówki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Obrazowanie
Wstęp
- Mikroglej to rezydentne makrofagi OUN, biorące udział w odpowiedziach immunologicznych i przycinaniu synaptycznym.
- Przycinanie synaptyczne przez mikroglej ma kluczowe znaczenie dla doprecyzowania obwodów neuronalnych podczas rozwoju oraz w przebiegu chorób.
- Mechanizmy przycinania synaptycznego pośredniczonego przez mikroglej w stanach neurozapalenia i neurodegeneracji nie są w pełni zrozumiałe.
- Modele eksplantów siatkówki umożliwiają kontrolowane badania ex vivo zachowania mikrogleju.
Cel badania
- Wizualizacja i kwantyfikacja ruchliwości mikrogleju oraz jego oddziaływań z białkami postsynaptycznymi w siatkówce myszy.
- Porównanie dynamiki mikrogleju w warunkach homeostazy oraz po urazie (laserowo indukowanym nadciśnieniu wewnątrzgałkowym).
- Przedstawienie protokołu wysokoprzepustowego obrazowania interakcji mikroglej-synapsa o wysokiej rozdzielczości.
Zastosowane metody
- Przygotowanie eksplantów siatkówki mysiej i ich mocowanie na papierze filtracyjnym w szalkach Petriego.
- Znakowanie synaps za pomocą AAV-PSD95-RFP.
- Mikroskopia konfokalna z dyskiem obrotowym w trybie time-lapse w celu rejestracji dynamiki mikrogleju i białek synaptycznych.
- Rekonstrukcja powierzchni 3D i punktów (spot reconstruction) przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu z segmentacją opartą na uczeniu maszynowym.
- Analiza ilościowa przemieszczania się mikrogleju, prędkości wypustek oraz kontaktu z punktami PSD95.
Główne wyniki
- Mikroglej w siatkówkach poddanych działaniu lasera wykazywał zwiększoną długość przemieszczenia wypustek oraz wyższą ruchliwość w porównaniu z grupą kontrolną.
- Liczba zdarzeń kontaktu między mikroglejem a punktami PSD95 wzrosła po uszkodzeniu wywołanym laserem.
- Obrazowanie time-lapse ujawniło większą złożoność mikrogleju oraz silniejszą kolokalizację synaptyczną po przejściowym podwyższeniu ciśnienia wewnątrzgałkowego.
- Protokół umożliwił wydajne obrazowanie i analizę wysokoprzepustową, pokonując ograniczenia metod in vivo.
Wnioski
- Niniejszy protokół ex vivo umożliwia szczegółową wizualizację i kwantyfikację interakcji między mikroglejem a synapsami w siatkówce.
- Motywność mikrogleju oraz kontakty synaptyczne ulegają nasileniu po uszkodzeniu neuronów.
- Metoda ta ułatwia badania nad zależnym od mikrogleju przycinaniem synaps w modelach chorób neurodegeneracyjnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe obrazowanie na żywo interakcji między mikroglejem a synapsami w siatkówce myszy ex vivo stanowi wysokoprzepustową i powtarzalną platformę do badania mechanizmów neuroimmunologicznych istotnych dla chorób neurodegeneracyjnych. Podejście to umożliwia precyzyjny pomiar ruchliwości mikrogleju oraz dynamiki kontaktów synaptycznych, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego i walidację celów na wczesnym etapie odkrywania leków. Skalowalność protokołu oraz wierność obrazowania ułatwiają rzetelną selekcję portfolio i ciągłość translacyjną programów terapeutycznych ukierunkowanych na OUN.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację przebudowy synaptycznej pośredniczonej przez mikroglej w warunkach homeostatycznych i po urazie.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnienie aktywnego demontażu synaps od usuwania resztek komórkowych.
- Zapewnia ilościowe wskaźniki do funkcjonalnej walidacji celów terapeutycznych w modelach neurozapalenia i neurodegeneracji.
- Ułatwia uzyskanie pewności prognostycznej w badaniu szlaków sygnałowych dla celów terapeutycznych w chorobach OUN.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Dostarcza zwalidowane i powtarzalne wyniki obrazowania dla dalszych etapów procesów przesiewowych.
- Standaryzuje kwantyfikację ruchliwości mikrogleju oraz zdarzeń kontaktu synaptycznego w celu opracowania testów.
- Umożliwia wysokoprzepustową i skalowalną analizę interakcji komórkowych z wykorzystaniem segmentacji opartej na uczeniu maszynowym.
- Przygotowuje stabilne systemy biologiczne do oceny związków w badaniach nad modulacją neuroimmunologiczną.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie wyników ex vivo z mechanizmami istotnymi dla choroby w modelach neurodegeneracji siatkówki.
- Zapewnia ciągłość procesu od fazy odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez ilościową ocenę dynamiki interakcji mikroglej-synapsa po urazie.
- Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju strategii neuroprotekcyjnych i immunomodulacyjnych w oparciu o analizę ryzyka.
- Dostarcza potencjalnych biomarkerów translacyjnych opartych na dynamicznych interakcjach komórkowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół obrazowania i analizy integruje etapy od wczesnego odkrywania po badania przedkliniczne, łącząc studia mechanistyczne z walidacją translacyjną w modelach chorób OUN.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie oddziaływań między mikroglejem a synapsami w celu wyjaśnienia szlaków neuroimmunologicznych i weryfikacji hipotez.
- Przesiewanie: Tworzenie powtarzalnych, ilościowych testów obrazowania do oceny potencjalnych interwencji.
- Analityka: Wyznaczanie parametrów przemieszczenia, prędkości i częstotliwości kontaktów w celu umożliwienia porównania warunków oraz analizy statystycznej.
- Badania translacyjne: Łączenie dynamiki komórkowej ex vivo z punktami końcowymi istotnymi dla procesów neurodegeneracyjnych.
- Zastosowania korporacyjne: Udostępnienie skalowalnej i adaptowalnej platformy dla różnorodnych procesów badawczych w obszarze OUN i neuroimmunologii.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów neuroimmunologicznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i przepustowość w testach opartych na obrazowaniu.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie skutecznej redukcji ryzyka na wczesnym etapie.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów na leki terapeutyczne w obszarze OUN.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obrazowaniu konfokalnym, analizie obrazu oraz neurobiologii.
- Wymaga dostępu do konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym oraz zaawansowanego oprogramowania analitycznego z segmentacją opartą na uczeniu maszynowym.
- Konieczna jest standaryzacja parametrów obrazowania i protokołów ekstrakcji danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do zaadaptowania do innych tkanek OUN lub modeli chorób przy zastosowaniu odpowiednich strategii znakowania.
- Przepustowość i skalowalność są ograniczone przez infrastrukturę obrazowania oraz wydajność przetwarzania danych.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:24
Time-Lapse Imaging of Mouse Retina for Tracking Analysis of Microglia and Synaptic Puncta
1:14
Microglial Surface Rendering and Tracking Analysis
3:56
Spot Classification for Postsynaptic Density Protein-95 (PSD95) to Detect Synaptic Puncta
5:54
Results
6:35
Conclusion
