Cytometria przepływowa i analiza pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania aktywacji mikrogleju we wczesnym pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy
3 października 2025
Protokół ten łączy cytometrię przepływową i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki w celu wyizolowania i scharakteryzowania stanów komórek mikrogleju w móżdżku wczesnych postnatalnych mózgów myszy. Wykorzystuje dysocjację enzymatyczną, wirowanie Percoll i barwienie immunologiczne, aby ujawnić heterogeniczność mikrogleju i poprawić zrozumienie ich roli w rozwoju i chorobie móżdżku.
Nasze badania badają, w jaki sposób mikroglej wpływa na naprawę mózgu po prenatalnym uszkodzeniu mózgu. Naszym celem jest ustalenie, czy modulowanie aktywności komórek mikrogleju może poprawić długoterminowe wyniki neurologiczne. Uważam, że jest to złożoność odpowiedzi komórek mikrogleju i wyzwania związane z opisaniem tych reakcji w najdokładniejszy sposób, aby odzwierciedlić fizjologiczne, ale także patologiczne reakcje i choroby.
Używamy różnych metod, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki i eksperymenty z cytometrią przepływową, aby scharakteryzować stany mikrogleju i funkcję w rozwijającym się mózgu po urazie prenatalnym. Głównym wyzwaniem jest zachowanie żywotności komórek i tożsamości mikrogleju podczas izolacji, zwłaszcza w punktach czasowych noworodków, kiedy liczba komórek móżdżku jest ograniczona. Rodzi to pytania o to, w jaki sposób uszkodzenia móżdżku we wczesnym okresie życia prowadzą do zmian transkrypcji w subpopulacji mikrogleju i jak terapie celowane mogą modulować te zmiany.
Aby rozpocząć, w razie potrzeby przeanalizuj określony obszar mózgu myszy. Za pomocą kleszczy przenieś tkankę na małą szalkę Petriego zawierającą pożywkę do hodowli komórek mikrogleju umieszczoną na lodzie, aby utrzymać żywotność komórek. Za pomocą pipety usunąć pożywkę do hodowli komórek mikrogleju z szalki Petriego.
Następnie, za pomocą skalpela, drobno przeciąć tkankę mózgową na tej samej szalce Petriego. Przenieś homogenizowaną tkankę mózgową do pięciomililitrowych probówek w celu trawienia enzymatycznego. Dodaj dwa mililitry zbilansowanego roztworu soli Hanksa uzupełnionego kolagenazą D i DNazą 1 do każdej probówki i szczelnie zamknij nakrętki Parafilmem.
Następnie inkubuj probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, potrząsając nimi co pięć minut. Aby zatrzymać trawienie, umieść rurki na lodzie. Następnie przepuść homogenat przez metalowy filtr siatkowy o grubości 140 mikrometrów, aby usunąć duże zanieczyszczenia.
Za pomocą szklanego tłuczka delikatnie oddziel pozostałe komórki na filtrze. Kilkakrotnie umyj metalowy filtr siatkowy trzema mililitrami pożywki do hodowli komórek mikrogleju na każde mycie. Teraz za pomocą 10-mililitrowej pipety zbierz filtrat i przenieś go do 15-mililitrowej probówki.
Następnie odwiruj probówkę o masie 500 g przez siedem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie odwróć probówkę, aby wyrzucić supernatant. Za pomocą stojaka delikatnie zeskrob rurkę, aby ponownie zawiesić pellet.
Następnie dodaj 10 mililitrów 37% roztworu pożywki koloidalnej na bazie krzemionki do zawieszonych komórek. Odwiruj roztwór o stężeniu 500 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy minimalnej sile zrywającej. Za pomocą 10-mililitrowej pipety odessać warstwę mieliny od góry roztworu.
Aby umyć komórki, dodaj 10 mililitrów zbilansowanego roztworu soli Hanksa i odwiruj probówkę z 500 g przez siedem minut w czterech stopniach Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu i ponownym zawieszeniu osadu, dodać do probówki 10 mililitrów aktywowanego fluorescencyjnie buforu do sortowania komórek. Po odwirowaniu ponownie zawiesić końcowe osady w pozostałym buforze do dalszych zastosowań.
Przenieś wszystkie wyizolowane komórki na 96-dołkową płytkę ze stożkowym dnem. Odwirować płytkę o masie 500 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Szybko odwróć płytkę jednym ruchem, aby wyrzucić supernatant.
Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w 25 mikrolitrach roztworu blokującego i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Aby przygotować zewnątrzkomórkową mieszaninę do barwienia przeciwciał, należy odwirować probówki z przeciwciałami o masie 10 000 g w celu usunięcia agregatów. Nie naruszając osadu, odessać wymaganą objętość z supernatantu.
Używając aktywowanego fluorescencyjnie bufora do sortowania komórek, dostosuj całkowitą objętość do 25 mikrolitrów. Teraz dodaj 25 mikrolitrów zewnątrzkomórkowej mieszanki barwiącej przeciwciała do każdej studzienki i inkubuj płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Bez mieszania dodać 150 mikrolitrów aktywowanego fluorescencyjnie buforu do sortowania komórek do każdej studzienki.
Odwirować płytkę o masie 500 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie szybko odwróć płytkę, aby usunąć supernatant jednym ruchem. Zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach aktywowanego fluorescencyjnie buforu do sortowania komórek i odwirować, jak pokazano wcześniej.
Ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach buforu saponinowo-paraformaldehydowego, aby utrwalić i przeniknąć komórki. Następnie inkubować płytkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Bez mieszania dodaj 100 mikrolitrów buforu saponin do każdej studzienki.
Odwirować płytkę o masie 500 g przez sześć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odwróć płytkę, aby usunąć supernatant jednym ruchem i ponownie zawieś osad komórkowy w 200 mikrolitrach buforu saponin. Następnie przygotuj kontrole kompensacyjne, dodając 20 mikrolitrów koralików do 11 pustych studzienek.
Aby przygotować wewnątrzkomórkową mieszaninę do barwienia przeciwciał, odwirować probówki z przeciwciałami o wadze 10 000 g w celu usunięcia potencjalnych agregatów. Nie naruszając osadu, odessać wymaganą objętość z supernatantu. Dostosuj objętość do 50 mikrolitrów za pomocą buforu saponinowego.
Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w 50 mikrolitrach wewnątrzkomórkowej mieszanki przeciwciał. Dodaj jeden mikrolitr każdego przeciwciała do odpowiednich studzienek perełkowych i inkubuj płytkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Bez mieszania dodaj 150 mikrolitrów buforu saponin do każdej studzienki zawierającej próbki komórek.
Dodaj 100 mikrolitrów aktywowanego fluorescencyjnie buforu do sortowania komórek do każdej studzienki kompensacyjnej, aby umyć kulki. Po odwirowaniu płytki ponownie zawiesić osad komórkowy i kontrole odpowiednio w 200 mikrolitrach buforu saponin i aktywowanego fluorescencyjnie buforu do sortowania komórek. Odwirować płytkę o masie 500 g przez sześć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant.
Ponownie zawiesić zarówno próbki komórek, jak i kontrole kompensacyjne w 200 mikrolitrach aktywowanego fluorescencyjnie buforu do sortowania komórek. Przenieść zawiesiny do znakowanych probówek do sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie. Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki zidentyfikowało odrębny klaster mikrogleju oddzielony od innych typów komórek mózgowych na podstawie profili transkrypcyjnych.
Analiza ekspresji różnicowej ujawniła znacznie podwyższoną regulację genów w mikrogleju, w tym Csf1r, Fcrls, Fyb, Adap2 i P2ry12. Komórki mikrogleju udało się wyizolować z żywych próbek mózgu w oparciu o ich wyraźną ekspresję markerów CD45 i CD11b. Odrębne subpopulacje mikrogleju zidentyfikowano na podstawie kombinacji markerów aktywacji, w tym CD80, CD86, iNOS, CD206 i Arg1, CD86 i CD64 oraz CD163 z CD206.
Ekspresja genów markerowych Ptprc i Itgam została zlokalizowana specyficznie w klastrze mikrogleju w projekcji umap, potwierdzając tożsamość tych komórek. Analiza wykresu skrzypcowego wykazała niższą ekspresję markerów przeciwzapalnych, takich jak Fcgr1 i Cd86, w leczonym mikrogleju w porównaniu z kontrolą nośnika.
Przegląd
Niniejszy protokół łączy cytometrię przepływową z sekwencjonowaniem RNA pojedynczych komórek w celu izolacji i charakterystyki stanów komórek mikroglejalnych w móżdżku myszy w wczesnym okresie postnatalnym. Wykorzystuje on dysocjację enzymatyczną i wirowanie w gradiencie Percoll wraz z immunobarwieniem, aby ujawnić heterogeniczność mikroglej, co pozwala na lepsze zrozumienie ich roli w rozwoju móżdżku oraz w przebiegu chorób.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia komórki
- Biologia rozwoju
Wprowadzenie
- Mikroglicia odgrywa kluczową rolę w rozwoju i funkcjonowaniu mózgu.
- Zrozumienie dynamiki mikrogleju może rzucić światło na jego rolę w przebiegu różnych chorób.
- Charakterystyka stanów mikrogleju jest niezbędna do opracowania terapii celowanych.
- Analizy pojedynczych komórek dostarczają wglądu w heterogeniczność komórkową.
Cel badania
- Wyizolowanie i scharakteryzowanie stanów mikrogleju w móżdżku.
- Pogłębienie zrozumienia roli mikrogleju w rozwoju mózgu.
- Wniesienie wkładu w wiedzę na temat zaangażowania mikrogleju w procesy chorobowe.
Zastosowane metody
- Główną wykorzystaną platformą jest cytometria przepływowa połączona z sekwencjonowaniem RNA pojedynczych komórek.
- Model biologiczny obejmuje wczesne postnatalne mózgi myszy, z koncentracją na mikrogleju móżdżku.
- Kluczowe etapy obejmują dysocjację enzymatyczną oraz wirowanie w gradiencie Percoll w celu izolacji komórek.
- Do dalszej analizy charakterystyki mikrogleju zastosowano techniki immunobarwienia.
Główne wyniki
- W badaniu pomyślnie wyizolowano stany komórek mikrogleju, wykazując ich heterogeniczność.
- Uzyskano nową wiedzę na temat roli mikrogleju w rozwoju móżdżku.
- Pogłębiono zrozumienie wpływu mikrogleju na mechanizmy chorobowe.
Wnioski
- Niniejsze badanie prezentuje niezawodną metodologię analizy stanów mikrogleju.
- Wnosi ono istotny wkład w zrozumienie mechanizmów neuronalnych oraz potencjalnych modeli chorobowych.
- Wyniki mogą utorować drogę do przyszłych strategii terapeutycznych ukierunkowanych na funkcje mikrogleju.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokorozdzielcza charakterystyka stanów aktywacji mikrogleju we wczesnym postnatalnym rozwoju mózgu myszy ma kluczowe znaczenie dla minimalizacji ryzyka związanego z celami terapeutycznymi w stanach neurozapalnych oraz dla zrozumienia mechanizmów rozwojowych. Integracja cytometrii przepływowej i sekwencjonowania RNA z pojedynczych komórek umożliwia solidne, ilościowe profilowanie heterogeniczności mikrogleju, co zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów i badaniach translacyjnych. Metody te stanowią odtwarzalny model rozwoju programów odkrywania w obszarze neuroimmunologii oraz dostarczają podstaw do decyzji portfelowych w ramach projektów dotyczących chorób neurorozwojowych i neurodegeneracyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną analizę stanów aktywacji mikrogleju oraz różnorodności populacyjnej.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez powiązanie ekspresji markerów powierzchniowych z profilami transkrypcyjnymi.
- Ułatwia mechanistyczną ocenę ryzyka w odniesieniu do szlaków neuroimmunologicznych we wczesnej fazie rozwoju.
- Dostarcza danych ilościowych niezbędnych do selekcji celów w procesach neurozapalnych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane strategie izolacji i bramkowania komórek w celu uzyskania powtarzalnych wyników w testach mikrogleju.
- Standaryzuje rozróżnianie komórek żywych od martwych oraz profilowanie markerów dla późniejszych etapów procesów przesiewowych.
- Umożliwia skalowalne przygotowanie wysokiej jakości zawiesin komórek neuronalnych do oceny związków.
- Wspiera ponowne wykorzystanie platformy w wielu warunkach eksperymentalnych i przy różnych perturbacjach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje fenotypowanie mikrogleju z sygnaturami transkrypcyjnymi istotnymi dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkryć po przedkliniczną walidację mechanizmów neuroimmunologicznych.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój modeli zaburzeń neurorozwojowych i chorób neurodegeneracyjnych.
- Stanowi podstawę do identyfikacji translacyjnych biomarkerów w patologiach napędzanych przez mikroglej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten dwumetodowy schemat pracy łączy wczesny etap odkryć z badaniami przedklinicznymi, umożliwiając precyzyjne profilowanie mikrogleju – od izolacji komórek po analizę transkrypcyjną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących aktywacji i różnorodności mikrogleju podczas rozwoju mózgu.
- Przesiewy: Zapewnia zestandaryzowane, ilościowe wyniki w zakresie ekspresji markerów mikrogleju oraz żywotności komórek.
- Analityka: Dostarcza wysokowymiarowe dane z pojedynczych komórek oraz wyniki różnicowej ekspresji genów do porównywania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy fenotypy mikrogleju ze stanami istotnymi dla przebiegu chorób oraz perturbacjami eksperymentalnymi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Oferuje adaptowalne protokoły dla różnych obszarów mózgu i schematów eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów neuroimmunologicznych oraz w zrozumieniu mechanizmów działania.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność, standaryzację i skalowalność przepływów pracy w profilowaniu mikrogleju.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach w portfolio dotyczącym neurostanów zapalnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i modeli neuroimmunologicznych w oparciu o analizę ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy z zakresu cytometrii przepływowej, sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek oraz obchodzenia się z tkanką nerwową.
- Wymaga dostępu do zaawansowanej aparatury oraz infrastruktury bioinformatycznej.
- Niezbędna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów izolacji komórek i bramkowania pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do zaadaptowania do innych obszarów mózgu po optymalizacji protokołu pod kątem specyfiki danej tkanki.
- Skuteczność zależy od zastosowania zwalidowanych przeciwciał oraz dokładnej kontroli żywotności i stanu komórek podczas przetwarzania.
