Zaktualizowany protokół montażu i użytkowania macierzy minibioreaktorów (MBRA)

Dlatego nasze badania koncentrują się na mikrobiomie jelitowym, a konkretnie na tym, jak można go zmodyfikować, aby zapobiec kolonizacji szkodliwych patogenów. Jednocześnie jesteśmy zainteresowani zrozumieniem ekologicznych reguł i mechanizmów stojących za tą odpornością na kolonizację. Technologie, takie jak sekwencjonowanie nowej generacji, zaawansowana bioinformatyka, myszy wolne od zarazków i modele jelitowe in vitro, zmieniają sposób, w jaki badamy społeczności drobnoustrojów i ich rolę w zdrowiu i chorobie.

Jednym z największych wyzwań związanych z modelami jelitowymi in vitro jest ich eksploatacja z dużą przepustowością. To, czego potrzebujemy, to systemy, które pozwolą na funkcjonalne badanie społeczności mikrobiologicznych na dużą skalę. Matryca minibioreaktorów to system hodowli o ciągłym przepływie, który został zaprojektowany w celu rozwiązania problemu braku przepustowości w innych systemach.

Pozwala nam to na zwiększenie skali eksperymentów, przy jednoczesnym uchwyceniu złożonych i powtarzalnych zachowań społeczności drobnoustrojów. Na początek upewnij się, że paski matrycy minibioreaktora są wydrukowane w 3D i zawierają sześć niezależnych komór bioreaktora. Ułóż wszystkie elementy potrzebne do montażu.

Za pomocą gwintownika 1/4 cala 28 NF z kluczem do gwintowników z rękojeścią T. Gwintuj trzy porty 1/4 cala w każdej komorze, aby włożyć złączki. Po umyciu komory wodą umieść w każdej komorze mieszadło magnetyczne o wymiarach 10 na 3 milimetry i dodaj jeden mililitr wody destylowanej.

Następnie umieść gumową podkładkę na górze każdego portu bioreaktora. Do każdej komory wkręć jedną przynętę męską z gwintem słomy z słomą, jedną przynętę męską z gwintem ze słomy odpadowej i jedną pustą przynętę męską z gwintem do portów. Teraz włóż sześć gumowych przegród na 3/32-calowe żeńskie zadziory przynęty i złóż górny rękaw każdej przegrody w dół, aby zakryć szyję.

Przymocuj je do wyznaczonych portów każdej komory. Wytnij paski rurek C-flex o żądanej długości i liczbie. Przymocuj 1/8-calowy żeński zadzior przynęty do jednego końca, a łącznik blokady męskiej przynęty do przeciwległego końca każdej długości rurki.

Następnie włóż 1/16-calową żeńską zadziorę przynęty do każdego końca czerwonej dwustopniowej rurki E-lab o średnicy wewnętrznej 1,14 milimetra i pomarańczowej dwuczęściowej rurki E-lab o średnicy wewnętrznej 0,89 milimetra. Podłącz przygotowaną rurkę E-lab do rurki C-flex i upewnij się, że każda z sześciu długości rurki C-flex jest podłączona do jednej czerwonej i jednej pomarańczowej żyłki E-lab za pomocą żeńskich przynęt. Następnie przytnij rurkę C-flex na różne długości zgodnie z wymaganiami.

Przymocuj 1/8-calowy żeński zadzior przynęty i męski łącznik blokady przynęty do obu końców jednego 3-calowego elementu i 12-calowego kawałka rurki C-flex. Przymocuj męskie łączniki blokady przynęty do obu końców pozostałych elementów. Zamontuj drzewo linii kanalizacyjnej zgodnie ze schematem 3D.

Przymocuj odsłonięte końce czerwonej rurki E-lab z dwoma przystankami do końcowych zamków męskiej przynęty na drzewie linki odpadowej w kolejności rosnącej w oparciu o długość rurki C-flex. Następnie połącz 3-calową rurkę C-flex z żeńskim zadziorem przynęty 1/8 cala i łącznikiem blokady przynęty męskiej do szczytu drzewa linii odpływowej. Zmontuj drzewo linii zasilającej zgodnie ze schematem 3D.

Połącz odsłonięte końce pomarańczowej rurki E-lab z dwoma przystankami do końcowych zamków męskiej przynęty na drzewie żyłki paszowej w kolejności rosnącej w oparciu o długość rurki C-flex i przymocuj 12-calową rurkę C-flex do górnej części drzewa linii zasilającej. Przymocuj rurkę C-flex o zmiennej długości na końcu drzewa linii zasilającej do bioreaktora, układając je w porządku rosnącym od najkrótszej linii po lewej stronie do najdłuższej po prawej. Przymocuj rurkę C-flex o zmiennej długości na końcu drzewa linii odpływowej do paska bioreaktora w kolejności malejącej, przy czym najdłuższa linia znajduje się po lewej stronie, a najkrótsza po prawej, aby dostosować się do umieszczenia pompy.

Zwiąż wszystkie przewody zasilające C-flex po lewej stronie paska i zabezpiecz je opaską zaciskową. Uformuj pętlę z pomarańczową rurką E-lab z dwoma przystankami między liniami C-flex i zabezpiecz pętlę za pomocą taśmy autoklawu, a następnie powtórz proces dla czerwonej rurki E-lab z dwoma przystankami po stronie odpadowej paska bioreaktora. Przykryj samicę przynęty na końcu odpadów i nakarm drzewa żyłki folią, aby zapobiec zanieczyszczeniu.

Poluzuj przynęty z gwintem zewnętrznym z przegrodami w każdej komorze bioreaktora, aby umożliwić ucieczkę pary podczas autoklawowania. Po umieszczeniu zestawu w pojemniku autoklawu, należy rozciągnąć drzewa linii paszowej i odpadowej do oddzielnych pojemników sąsiadujących z tym, w którym znajdują się paski MBRA. Aby przymocować system do pomp, usuń taśmę autoklawu mocującą rurki E-lab zarówno do przewodów odpływowych, jak i zasilających, a następnie rozwiąż wiązki przewodów C-flex.

Umieść MBRA między dwiema pompami na górze płyty mieszającej. Zaciśnij go za pomocą uchwytów wydrukowanych w 3D i wyrównaj z zaznaczonymi pozycjami mieszania na płycie. Teraz podłącz rurkę E-lab przewodu zasilającego do wkładów pompy perystaltycznej i umieść ograniczniki przewodów w szczelinach wkładów.

Powtórz ten proces dla rurki przewodu odpływowego E-lab na pompie znajdującej się po prawej stronie płytki mieszającej. Następnie zablokuj wkłady pompy perystaltycznej w pompie. Ułóż rurki C-flex starannie za pomocą uchwytów na rurki wydrukowane w 3D.

Podłącz koniec drzewa linii odpływowej do rurki podłączonej do butelek na odpady. Następnie przymocuj żeńską przynętę na rurce wejściowej przewodu zasilającego do męskiego złącza na 12-calowej rurce z nakrętki butelki z mediami. Włącz obie pompy, aby rozpocząć przepływ mediów i upewnij się, że obie pompy są ustawione na obrót zgodnie z ruchem wskazówek zegara, gdy odpady są umieszczone po prawej stronie pomp.

Obserwuj wielkość i rytm kropel w każdej komorze bioreaktora. Jeśli zauważysz jakąkolwiek zmienność lub nieprawidłowość, wymień pomarańczową dwustopniową rurkę E-lab podłączoną do komory, której dotyczy problem, aby zmniejszyć zmiany natężenia przepływu. Gdy komory są pełne, wyłącz obie pompy i pozwól bioreaktorom siedzieć przez 24 do 48 godzin, aby sprawdzić zanieczyszczenie przed rozpoczęciem eksperymentu.

Przełącz wejście mediów na jednolitrowy pojemnik z 10% wybielaczem w wodzie dejonizowanej i zwiększ natężenie przepływu na obu pompach do maksimum, aby wyprzeć zawartość komór bioreaktora z wybielaczem. Gdy komory zostaną oczyszczone z mediów, odwróć MBRA, aby dezynfekować powyżej linii napełniania przez pięć minut. Po pięciu minutach wypraw system i odczekaj dodatkowe pięć minut na sterylizację.

Po oczyszczeniu komór z pożywki i sterylizacji przez 10 minut, zastąp wybielacz jednym litrem wody dejonizowanej i przepłucz system, aż woda przejdzie. Następnie odłącz rurki E-lab bioreaktora od pomp i wyjmij MBRA. Usuń zużyte przegrody z bioreaktora i opróżnij każdą komorę, aż pozostanie tylko jeden mililitr wody.

Wymień przegrodę, pomarańczową rurkę E-lab z dwoma przystankami i autoklaw całkowicie zmontowany pasek, jak pokazano wcześniej. Po trzech cyklach ponownego użycia wykonaj następujące kroki. Próbkę kału ludzkiego przygotowano i wyhodowano w systemie MBRA.

Po czterech dniach ciągłego przepływu, społeczność mikroorganizmów we wszystkich dziewięciu bioreaktorach została zdominowana przez 18 rodzajów bakterii, z których każdy zawierał co najmniej 2% względnej liczebności w dowolnej kontrpróbie. 22 z 65 wykrytych rodzajów było obecnych we wszystkich dziewięciu powtórzeniach bioreaktorów, wykazując wysoką odtwarzalność. Analiza różnorodności alfa wykazała minimalną zmienność między powtórzeniami zarówno w obserwowanych operacyjnych jednostkach taksonomicznych, jak i w indeksie różnorodności Shannona.