Ilościowa identyfikacja pochłaniania kwasów tłuszczowych śródbłonka za pomocą analogów kwasów tłuszczowych fluorescencyjnych
15 sierpnia 2025
Protokół ten opisuje test in vitro do pomiaru pobierania lipidów komórkowych przez komórki śródbłonka po stymulacji fluorescencyjnymi analogami BODIPY-C12 i BODIPY-C16 nasyconych kwasów tłuszczowych długołańcuchowych i bardzo długołańcuchowych. Ta metoda jest wydajna i adaptowalna do innych typów komórek, oferując użyteczne podejście do badania metabolizmu lipidów.
Składniki odżywcze przenoszone przez krew, takie jak kwasy tłuszczowe, muszą przekroczyć barierę śródbłonkową kapilary, aby dostać się do tkanek metabolicznych za pomocą słabo poznanych mechanizmów. Wyjaśnienie tych procesów może ujawnić nowe cele terapeutyczne w leczeniu chorób metabolicznych, takich jak cukrzyca typu 2. Odkryliśmy, że mięśnie skalpela i tkanka tłuszczowa regulują pobieranie i transport lipidów śródbłonka za pomocą metabolitów parakrynowych, częściowo kontrolowanych także przez układ hormonalny.
Również odkryliśmy, że mitochondrialne ATP niespodziewanie przyczyniają się do pobierania tłuszczu przez śródbłonek, mimo że są znane jako uzależnione od glikolitycznego ATP. Korzystając z testu opisanego w tym protokole, planujemy głębiej zbadać molekularne mechanizmy leżące u podstaw pobierania i transportu kwasów tłuszczowych śródbłonka, w tym tego, jak mogą być one regulowane przez inne tkanki. Na początek przygotuj roztwór żelatyny o stężeniu 0,1%, dodając 25 mililitrów 2% żelatyny do 475 mililitrów PBS.
Dokładnie wymieszaj roztwór żelatyny i sterylizuj filtrem za pomocą 0,2-mikrometrowego filtra próżniowego lub autoklawu. Za pomocą pipety dodaj 100 mikrolitrów roztworu żelatyny 0,1% do każdego dołka czarnej, przezroczystej płytki z 96 dołkami na dnie. Włóż talerz do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na co najmniej 30 minut lub na noc.
Po inkubacji usuń nadmiar roztworu żelatyny z wcześniej powlekanej płytki z 96 dołkami. Umyj talerz PBS raz. Następnie pipetą wszczep 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdego dołku, używając gęstości zasiewniczej, która pozwala komórkom osiągnąć zbieg do następnego dnia.
Przygotuj roztwory 20 milimolarowych 3-hydroksyzobutyranu i mleczanu jako dodatnie kontrole. Do kontroli negatywnej użyj jednego mikrotrzonowcowego niklosamidu. Następnie pipetuję roztwory do osobnej płytki z 96 dołkami.
Raz umyj komórki śródbłonka podgrzanym dwuwartościowym PBS, pipetując pod ostrym kątem, aby nie zakłócać komórek pokrytych płytami. Dodaj 50 mikrolitrów odpowiedniego odczynnika do leczenia na dołek i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 lub 60 minut. Aby przygotować kompleks kwasów tłuszczowych BSA BODIPY, wymieszaj 2-mikromolowy roztwór kwasów tłuszczowych BODIPY z 1 mikromolarowym BSA wolnym od kwasów tłuszczowych w PBS.
Inkubuj mieszankę w temperaturze pokojowej w ciemności przez 10 minut przed użyciem. Następnie do każdego dobrze obtraktowanego składnika dodaj 50 mikrolitrów przygotowanego kompleksu kwasów tłuszczowych BSA i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Przygotuj roztwór BSA bez kwasów tłuszczowych o pojemności 1 mikromolara w PBS jako bufor do płukania i podgrzej go do 37 stopni Celsjusza.
Usuń kompleks kwasów tłuszczowych BSA BODIPY z dołków i przemyj całą płytę dwukrotnie 50 mikrolitrami wcześniej podgrzanego buforu do płukania, wykonując każde płukanie przez 1,5 minuty. Następnie do każdego dołku dodaj 50 mikrolitrów 0,08% trypanowego niebieskiego, aby stłumić fluorescencję zewnątrzkomórkową. Za pomocą czytnika mikropłytek natychmiast zmierz fluorescencję wewnątrzkomórkową.
Po usunięciu roztworu trypan blue z dołków delikatnie umyj komórki PBS. Do każdego dołku dodaj 4 mikrogramy na mililitr barwnika Hoechst rozcieńczonego w 10% media. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.
Następnie umyj talerz raz PBS, żeby usunąć nadmiar barwnika. Następnie dodaj świeży PBS do każdego dołka i zmierz fluorescencję Hoechst za pomocą czytnika mikropłytek. W komórkach HUVEC i EA.hy926 sygnał BODIPY-C12 wewnątrzkomórkowy wzrósł istotnie przy wyższych stężeniach kwasów tłuszczowych BODIPY po jednej minucie, pięciu minutach i 10 minutach inkubacji.
Leczenie laktanem przez godzinę zwiększało pobieranie BODIPY-C12 w zależności od dawki przy stężeniach 5 milimolowych i 20 milimolowych. Leczenie 3-hydroksizobutyranem znacząco zwiększyło również pobieranie BODIPY-C12 w zależności od dawki, z najwyższym wychwytem 20 milimolowym. Leczenie jednym mikrotrzonowcem niklosamidem przez 30 minut spowodowało istotne zmniejszenie wychwytu BODIPY-C12 w porównaniu z kontrolą DMSO bez leczenia.
Po pięciominutowej inkubacji BODIPY-C16 w HUVEC, leczenie mleczanem na 10 milimolowych i 20 milimolowych znacząco zwiększyło wchłanianie w zależności od dawki. Leczenie 1 mikrotrzonowcem niklosamidem istotnie zmniejszyło wychwyt BODIPY-C16 w porównaniu z kontrolą DMSO bez leczenia.
Przegląd
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje test in vitro służący do pomiaru komórkowego poboru lipidów w komórkach śródbłonka z wykorzystaniem fluorescencyjnych analogów kwasów tłuszczowych BODIPY. Metoda ta jest wydajna i elastyczna, dostarczając istotnych informacji na temat metabolizmu lipidów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Metabolizm lipidów
- Funkcje komórek śródbłonka
Wstęp
- Kwasy tłuszczowe muszą przekroczyć barierę śródbłonkową, aby przedostać się do tkanek metabolicznych.
- Mechanizmy tego procesu nie są jeszcze dobrze poznane.
- Zrozumienie tych mechanizmów mogłoby doprowadzić do wskazania nowych celów terapeutycznych w leczeniu chorób metabolicznych.
- Wcześniejsze odkrycia wskazują, że tkanka mięśniowa i tłuszczowa regulują pobieranie lipidów przez śródbłonek.
Cel badania
- Wyjaśnienie molekularnych mechanizmów leżących u podstaw pobierania kwasów tłuszczowych przez śródbłonek.
- Zbadanie, w jaki sposób pobieranie lipidów jest regulowane przez inne tkanki.
- Wykorzystanie testu in vitro do szczegółowej analizy metabolizmu lipidów.
Zastosowane Metody
- Przygotowanie płytek 96-dołkowych powlekanych żelatyną do hodowli komórkowej.
- Wykorzystanie analogów kwasów tłuszczowych BODIPY do pomiaru poboru lipidów.
- Inkubacja komórek śródbłonka z różnymi substancjami traktującymi.
- Pomiar fluorescencji wewnątrzkomórkowej w celu ilościowego oznaczenia poboru lipidów.
Główne wyniki
- Zwiększenie sygnału BODIPY-C12 przy wyższych stężeniach kwasów tłuszczowych.
- Laktat i 3-hydroksyizobutyran zwiększały pobór BODIPY-C12 w sposób zależny od dawki.
- Leczenie niklozamidem znacząco zredukowało pobór kwasów tłuszczowych.
- Pobór BODIPY-C16 był również zwiększony po podaniu laktatu.
Wnioski
- Analiza ta zapewnia niezawodną metodę badania poboru lipidów w komórkach śródbłonka.
- Wyniki sugerują potencjalne role regulacyjne metabolitów parakrynnych.
- Dalsze badania mogą przynieść nowe informacje na temat mechanizmów chorób metabolicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe oznaczanie wychwytu kwasów tłuszczowych przez komórki śródbłonka z wykorzystaniem analogów fluorescencyjnych wypełnia istotną lukę w badaniach nad wczesnymi stadiami chorób metabolicznych, umożliwiając wiarygodny i skalowalny pomiar dynamiki transportu lipidów. Metoda ta zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów terapeutycznych oraz minimalizuje ryzyko mechanistyczne na etapie odkrywania, bezpośrednio wpływając na decyzje dotyczące portfolio programów badań nad chorobami metabolicznymi i naczyniowymi. Jej adaptacyjność oraz wyniki ilościowe sprawiają, że stanowi ona uniwersalną platformę dla interdyscyplinarnych zespołów badawczo-rozwojowych (R&D).
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę mechanizmów transportu lipidów w komórkach śródbłonka, istotnych w kontekście chorób metabolicznych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez ilościowe określenie wychwytu kwasów tłuszczowych o określonej długości łańcucha.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki zastosowaniu kontroli pozytywnych i negatywnych.
- Dostarcza danych ilościowych pozwalających na określenie pewności predykcyjnej oraz selekcję wczesnych celów terapeutycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia ustandaryzowany format wysokoprzepustowy w płytkach 96-dołkowych dla powtarzalnego pomiaru wychwytu FA.
- Umożliwia skalowalność testu i ponowne wykorzystanie platformy w przypadku pierwotnych i unieśmiertelnionych linii komórek śródbłonka.
- Wspiera rzetelną ocenę związków dzięki odczytom wychwytu zależnym od czasu i dawki.
- Poprawia bezpieczeństwo i zwiększa szybkość badania w porównaniu z metodami z użyciem znaczników promieniotwórczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z systemami istotnymi dla przebiegu chorób poprzez modelowanie transportu śródbłonkowego w kontekstach metabolicznych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną dzięki obsłudze formatów badania żywych komórek oraz analizy pulse-chase.
- Stanowi platformę do oceny translacyjnych biomarkerów gospodarki lipidowej śródbłonka.
- Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez wyjaśnianie mechanizmów regulacyjnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy test wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, wspierając testowanie hipotez, walidację celów oraz badania translacyjne w ramach opracowywania leków na choroby metaboliczne i naczyniowe.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe pomiary wychwytu FA wyjaśniają ścieżki transportu śródbłonkowego oraz mechanizmy regulacyjne.
- Przesiewanie: Wysokoprzepustowe, powtarzalne wyniki umożliwiają przesiewanie związków i ścieżek w zwalidowanych systemach komórkowych.
- Analityka: Odczyty oparte na fluorescencji i normalizacja do liczby komórek zapewniają solidne i porównywalne dane w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Możliwość adaptacji do formatów live-cell oraz pulse-chase wspiera dopasowanie biomarkerów i modelowanie chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Wszechstronność platformy pozwala na adaptację do różnych typów komórek i warunków eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad transportem lipidów w komórkach śródbłonka.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje kwantyfikację poboru FA dzięki skalowalnym i powtarzalnym procesom roboczym.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań oraz efektywne zarządzanie kapitałem w ramach portfolio.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój celów terapeutycznych w chorobach metabolicznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie hodowli komórek śródbłonka oraz ilościowego oznaczania fluorescencji.
- Wymagany jest dostęp do czytników mikropłytek oraz kompatybilnej infrastruktury obrazowania.
- Konieczna jest standaryzacja kontroli i protokołów normalizacji pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych typów komórek i modalności obrazowania po optymalizacji protokołu.
- Ograniczenia obejmują zależność od wierności poboru analogowego oraz odpowiedzi specyficznych dla danej linii komórkowej.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:59
Gelatin Coating of 96-Well Plate and Cell Seeding
2:06
Treatment Reagent Preparation and Application
3:23
Fluorescence Quenching and Intracellular Signal Detection
4:07
Hoechst Nuclear Staining for Cell Normalization
4:43
Results
![Opracowanie i charakterystyka sieci mikronaczyń in vitro oraz pomiary ilościowe produkcji śródbłonka [Ca2+]i i tlenku azotu](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F54014.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A18.166Z&w=384&q=75)
