Praktyczny schemat analizy danych z transkryptomiki przestrzennej: od pozyskiwania danych po analizy zaawansowane

Witajcie wszyscy. W tym filmie przeanalizujemy praktyczny potok analizy danych z transkryptomiki przestrzennej, od pozyskiwania i ładowania danych, przez podstawową eksplorację, aż po analizy zaawansowane. Cały proces składa się z trzech głównych etapów.

W pierwszej kolejności należy pobrać dane, następnie uzyskać kod analityczny, a na koniec uruchomić potok przetwarzania w celu wygenerowania wyników. Krok pierwszy: pozyskanie danych i przygotowanie struktury katalogów. Najpierw należy pozyskać publiczne zestawy danych z transkryptomiki przestrzennej.

Pobierz archiwum z surowymi danymi. Następnie rozpakuj archiwum. Zorganizuj pliki w ustandaryzowanej strukturze katalogów.

Najpierw należy utworzyć główny katalog danych, a następnie dedykowany podkatalog dla każdej próbki. Przenieś następujące niezbędne pliki dla każdej próbki do odpowiedniego podkatalogu. Następnie utwórz podfolder przestrzenny wewnątrz katalogu każdej próbki.

Umieść następujące pliki w podfolderze spatial. Umieść plik S1 z metrykami PC przefiltrowanych cech w głównym podkatalogu próbki. Rozpakuj pliki gzip w folderze spatial.

Upewnij się, że oryginalne nazwy plików pozostają dokładnie takie, jak wymagają tego funkcje ładowania danych spatial 10X. Krok drugi: konfiguracja środowiska programistycznego. W tym miejscu pomijamy instalację języka R, a proces rozpoczyna się od pobrania skryptu analitycznego z repozytorium GitHub.

Zainstaluj wymagane pakiety R z Graham w programie File Conductor, uruchamiając skrypt setup R. Zainstaluj AutoSuit, wykonując polecenia instalacyjne podane w oficjalnym arkuszu dokumentacji. Przejdź do oficjalnego adresu URL instalacji, aby pobrać skrypty konfiguracyjne. Zainicjuj wymagane środowisko Python oraz zależności systemowe zgodnie z instrukcjami na stronie konfiguracji.

Uzyskaj niestandardowe narzędzie, przechodząc do repozytorium GitHub, i pobierz kod źródłowy. Przejdź do katalogu TOS i zainstaluj zależności języka Python. Krok trzeci: ładowanie danych przestrzennych i kontrola jakości.

Wczytaj dane przestrzenne do obiektu Seurat. Użyj funkcji read 10X image, aby ręcznie załadować wysokorozdzielczy obraz tkanki, określając ścieżkę do obrazu oraz jego nazwę.

Użyj funkcji load 10X spatial z parametrem image ustawionym na obiekt obrazu utworzony w poprzednim kroku i utwórz obiekt Seurat. Oblicz wskaźniki kontroli jakości. Oblicz procent odczytów mitochondrialnych, używając funkcji PercentageFeatureSet z wzorcem mt.

Wizualizuj i interpretuj dane na podstawie wskaźników kontroli jakości (QC). Wygeneruj wykresy skrzypcowe dla nCount_Spatial, nFeature_Spatial oraz percent.mt, korzystając z funkcji wykresu skrzypcowego.

Utwórz wykresy cech przestrzennych dla tych metryk, korzystając z wykresów cech przestrzennych. Następnie zidentyfikuj plamy znajdujące się poza obszarem tkanki. Opcjonalnie zastosuj filtry w celu usunięcia plam o niskiej jakości.

Po uruchomieniu skryptu można uzyskać następujące wyniki, w tym wskaźniki kontroli jakości (QC) oraz wykres przestrzenny cech. Krok czwarty: wstępne przetwarzanie danych, integracja i klasteryzacja. Przeprowadź normalizację podczas wstępnego przetwarzania poszczególnych próbek.

Zastosuj normalizację SCTransform dla każdej próbki oddzielnie z użyciem parametrów assay Spatial. Zintegruj wiele próbek. Przygotuj listę obiektów znormalizowanych za pomocą SCTransform do integracji.

Upewnij się, że każdy obiekt posiada analizę RNA poprzez skopiowanie analizy przestrzennej. Użyj funkcji select integration w integracji PREP SCT, aby zidentyfikować wspólne cechy zmienne. Znajdź kotwice integracji za pomocą funkcji find integration anchors, stosując metodę normalizacji SCT.

Zintegruj dane za pomocą funkcji IntegrateData. Przeprowadź redukcję wymiarowości w klastrowaniu na zintegrowanym badaniu. Uruchom analizę PCA na zintegrowanych danych, korzystając z funkcji runPCA.

Wyznacz optymalną liczbę głównych komponentów do dalszej analizy poprzez obliczenie skumulowanej wariancji wyjaśnionej. Programowo zidentyfikuj punkt przegięcia (tzw. elbow point). Uruchom algorytm UMap, korzystając z wyznaczonej liczby PC.

Pogrupuj komórki, korzystając z funkcji FindNeighbors i FindClusters. Określ wyznaczone PC przy ustawieniu resolution na 0.5. Przeprowadź analizę ekspresji różnicowej między grupami docelowymi za pomocą funkcji FindWorkers.

Zidentyfikuj geny o zmienności przestrzennej. Dla każdej oryginalnej próbki uruchom funkcję find spatially variable features, stosując metodę Moran's I w ramach analizy SCT, aby obliczyć przestrzenną autokorelację. Po uruchomieniu tego skryptu można uzyskać wykres łokciowy (elbow plot), wykres UMap, wykres klastrów, mapę ciepła markerów klastrów, wykres wulkaniczny (volcano plot), geny o różnej ekspresji cech przestrzennych, geny wiarygodne przestrzennie oraz markery warstw jelita grubego.

Oraz wykres punktowy markerów warstwy okrężnicy, wraz z markerami na wykresie cech przestrzennych. Krok piąty, wstępne przetwarzanie referencyjnych danych jednokomórkowych. Odczytaj macierz zliczeń RNA-seq z pojedynczych komórek za pomocą funkcji read 10X i utwórz obiekt Seurat.

Przeprowadź standardową normalizację QC oraz usuwanie klastrów (declustering). Oblicz procent odczytów mitochondrialnych w filtrowanych komórkach. Znormalizuj dane przy użyciu transformacji SC.

Ustaw zmienną do regresji percent.mt. Wykonaj analizę PCA, UMap i zgrupuj komórki, korzystając z metody dynamicznego wyboru PC opisanej w poprzednich krokach, a następnie przypisz typy komórek.

Oblicz wyniki modułów dla kanonicznych genów markerowych typów komórek przy użyciu funkcji AddModuleScore. Przypisz adnotacje do klastrów na podstawie wyników modułów oraz znanej biologii. Alternatywnie zaimportuj wcześniej obliczone adnotacje z metadanych.

Po uruchomieniu tego skryptu można uzyskać metryki kontroli jakości (QC). Przesłano wykresy UMap z podziałem na klastry, UMap z podziałem na próbki oraz wyniki dla typów komórek. Krok szósty to dekonwolucja prowadzona przez referencję przy użyciu SPOTlight.

W pierwszej kolejności należy przygotować dane do analizy w programie SPOTlight. Obiekt Seurat z adnotacjami dla pojedynczych komórek oraz przestrzenny obiekt Seurat należy przekonwertować na obiekt SingleCellExperiment. Następnie należy przeprowadzić logarytmiczną normalizację danych z pojedynczych komórek przy użyciu funkcji LogMoreCounts.

Następnie przeprowadź dekonwolucję SPOTlight. Najpierw zidentyfikuj geny o wysokiej zmienności w danych jednokomórkowych, korzystając z ModelGeneVar. Oblicz markery typów komórkowych za pomocą score markers i odfiltruj markery o wysokiej jakości.

Zredukuj próbkę referencyjną dla pojedynczych komórek dla każdego typu komórek do zarządzalnej liczby, aby skrócić czas obliczeń. Przeprowadź dekonwolucję za pomocą funkcji SPOTlight, podając referencję dla pojedynczych komórek, dane przestrzenne, listę markerów oraz HVG, a następnie zwizualizuj i wyeksportuj wyniki. Wynik dekonwolucji można uzyskać w następujący sposób, przedstawiając go jako ścieżkę rur przewodzących (scatter pipe route).

Krok siódmy: nienadzorowana dekonwolucja z użyciem Stdeconvolve. Najpierw należy przygotować dane przestrzenne. Wyekstrahuj metryki liczby odczytów w wierszach z przestrzennego obiektu Seurat, korzystając z funkcji GetAssayData z gniazdem counts.

Usuń plamki i geny o niskiej jakości, wykorzystując oczyszczone dane liczbowe z narzędzia STdeconvolve. Zidentyfikuj utajone typy komórek dla filtrów, w których korpus czterech genów wykazuje ekspresję w minimalnym ułamku plamków, stosując restrykcyjną analizę LDA poprzez zastosowanie modelu alokacji w zakresie potencjalnych liczb tematów za pomocą funkcji fitLDA. Wybierz optymalny model na podstawie minimalnej złożoności, korzystając z funkcji optimal model z parametrem opt min.

Przeanalizuj i zwizualizuj wyniki. Wyodrębnij proporcje serotypów Theta oraz profile genów Beta dla optymalnego modelu za pomocą funkcji getBetaTheta. Aby dodać biologiczną interpretację zagadnień związanych z korozją, zaimportuj adnotacje obszarów zainteresowania wygenerowane przez narzędzie do wyboru plamek przestrzennych.

Użyj tych adnotacji jako parametru grupy w funkcji z wszystkimi tematami. Nałóż na swój projekt odsplotowane proporcje typów komórek z powrotem na współrzędne przestrzenne i zakoduj kolorami plamki według ich ROI. Po uruchomieniu skryptu otrzymasz wynik taki jak ten, obciążenie rurociągu skali, podobny do tych generowanych przez SPOTlight.

Krok ósmy, analiza przestrzennej komunikacji międzykomórkowej przy użyciu programu Giotto. Najpierw przekształć obiekt Seurat w obiekt Giotto. Użyj funkcji createGiottoObject, podając metryki o niskiej liczbie zliczeń oraz współrzędne przestrzenne.

Przeprowadź wstępne przetwarzanie obiektu Giotto i dodaj wynik dekonwolucji. Znormalizuj dane za pomocą funkcji normalized Giotto, a następnie dodaj adnotacje serotypów. Wybierz metadane komórek przy użyciu funkcji addCellmetadata.

Utwórz sieć przestrzenną za pomocą funkcji createSpatialNetwork. Wczytaj bazę danych ligandów i receptorów do środowiska. Uruchom funkcję exploreCellCellcom, aby zidentyfikować istotne interakcje ligand-receptor pomiędzy typami komórek znajdującymi się w bliskim sąsiedztwie przestrzennym.

Wykres kropkowy komunikacji międzykomórkowej można uzyskać w następujący sposób. Krok dziewiąty jest opcjonalny. Interaktywny wybór punktów za pomocą SelectSpatialSpot.

Przygotuj dane do interaktywnego narzędzia, korzystając ze skryptu six. Wyodrębnij współrzędne przestrzenne z obiektu Seurat za pomocą funkcji GetTissueCoordinates. Sformatuj i wyeksportuj dane.

Wyeksportuj ramkę danych formacyjnych do pliku CSV. Następnie przeprowadź analizę obszaru zainteresowania (ROI). Uruchom niestandardowy program.

Wybierz aplikację „spatial spots dash” i wczytaj plik CSV. Interaktywnie zaznacz punkty na podstawie ich lokalizacji przestrzennej. Następnie wyeksportuj listę wybranych punktów wraz z przypisanymi do nich grupami, zapisując je w nowym pliku CSV.

Weryfikujemy teraz wyniki uzyskane po kolejnym uruchomieniu skryptów. Wszystkie dane zostały zapisane w folderze results five-fold. Jak widać, otrzymaliśmy metryki kontroli jakości (QC) oraz wartości dzielenia.

Wykres cech przestrzennych można sprawdzić tutaj. Ponadto proces dekonwolucji został przeprowadzony zarówno w sposób nadzorowany, jak i nienadzorowany. Wyniki analizy SPOTlight znajdują się tutaj.

Jak widać, wszystkie plamki zawierają informacje o proporcjach. Wygenerowano tutaj również wyniki dekonwolucji nienadzorowanej za pomocą STdeconvolve. a to są wyniki klastrowania Seurat dla plamek w danych przestrzennych.

Można je również zwizualizować na wykresie zespołów przestrzennych, w ten sposób. Co więcej, za pomocą Giotto można uzyskać wyniki komunikacji między punktami. Cały ten proces jest w 100% open source.

Analiza punktowa – od wskaźników ekspresji po zaawansowane modelowanie przestrzenne. Wszystkie kroki są wykonywane na maszynie z 16GB RAM. Baza kodu jest modułowa, z jednym skryptem dla każdego zadania.

Należy zauważyć, że ten rurociąg nie obejmuje przetwarzania wstępnego z plików FASTQ. Koncentracja skupia się na dwuwymiarowych danych przestrzennych i obecnie obejmuje wyłącznie moduły pobierania danych Visium. To wszystko, dziękujemy za oglądanie.