12 czerwca 2026
Przedstawiono protokół eksperymentalny do składania, stymulacji elektrycznej i analizy kropli dwuwarstwy lipidowych zmodyfikowanych gramicydyną A. Relacje struktura-funkcja lipidów i białek są ilościowo określane poprzez pomiar zmian w obszarze błony, przepływie jonowym i przewodnictwie pojedynczego kanału oraz odniesienie tych reakcji do zmian przypominających plasticzne zmiany w przewodnictwie jonowym w modelu błony inspirowanym synapsami elektrycznymi.
W tej pracy badamy, jak fizyczne i elektryczne właściwości błon lipidowych i ich środowisko wpływają na przewodzenie jonów w modelowych systemach dwuwarstwy interfejsowych kropli. Tradycyjna elektrofizjologia zapięciowa nie bada szeroko zakreślonej biofizyki błon, ale ta pojedyncza platforma uchwytuje zarówno aktywność pojedynczych kanałów, jak i obszary błony o większej skali w skali milimetrów, aby bardziej szczegółowo badać biofizykę błony. Na początek przygotuj zelektrodowane srebrne druty pokryte chlorowanym agarozami i roztwory pęcherzyków lipidowych do eksperymentów elektrofizjologicznych.
Do utworzenia dwuwarstwy interfejsowej kropli, umieść przezroczysty pojemnik Petriego na scenie odwróconego mikroskopu. Napełnij pojemnik olejem alkanowym, takim jak 100% heksadekanem, na głębokość około pięciu milimetrów. Po podłączeniu elektrod do głowicy zapięciowej i uchwytu elektrody uziemiającej, użyj kontrolek mikromanipulatora, aby opuścić oba zakończenia kulkowe pokryte agarozą do oleju na głębokość około 2,5 milimetra poniżej powierzchni oleju, unikając szybkiego ruchu, aby zapobiec kolizjom z pojemnikiem Petriego.
Dostosuj fokus mikroskopu, aż oba zakończenia kuli i ich powłoki agarozowe będą w ostrości. Umieść elektrodę w pobliżu krawędzi pola widzenia, aby oba mogły być obserwowane jednocześnie. Używając skalibrowanej pipety dwu-mikrolitrowej, zasysaj wypychane pęcherzyki lipidowe DPhPC dopinane gramicydyną A. Powoli wydzielaj 250 nanolitrów zawiesiny bezpośrednio na każde zakończenie kuli pokrytych agarozą, używając oddzielnej końcówki pipety dla każdej, nie dotykając powłoki agarozowej.
Pozwól kroplom rozprzestrzenić się na powierzchni agarozy i widocznie opuścić się w dół z powodu grawitacji i zmniejszonego napięcia powierzchniowego, tworząc kształt kropli wiszącej. Obserwuj opadanie z boku przez ściankę pojemnika Petriego, jeśli jest przezroczysty. Po pięciu minutach delikatnie potrząśnij stołem antywibracyjnym, aby ocenić kroplę.
Potwierdź, że opadanie kropli opóźnia się nieznacznie w stosunku do ruchu elektrod, co wskazuje na utworzenie całkowicie pokrytych kropli monowarstw lipidowych. Jeśli takiego zachowania nie zaobserwuje się, poczekaj dodatkowe dwie do trzech minut i powtórz ocenę. Upewnij się, że mikroskop, stół antywibracyjny, klatka Faradaya, wzmacniacz, przetwornik cyfrowy, generator funkcji i komputer są podłączone do wspólnej uziemienia.
Ułóż połączenia instrumentów zgodnie z przewodnikiem konfiguracji producenta i skonfiguruj podstawową konfigurację elektryczną i optyczną, postępując zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami dotyczącymi eksperymentów z dwuwarstwą interfejsową kropli. Skonfiguruj zewnętrzny generator funkcji lub kanał wyjściowy oprogramowania akwizycyjnego, aby wygenerować falę napięcia trójkątnego o częstotliwości 10 Hz i amplitudzie 10 mV. Potwierdź amplitudę i częstotliwość na podłączonym oscyloskopie i w oprogramowaniu akwizycyjnym.
Po tym, jak krople opuściły się przez około 10 minut, użyj mikromanipulatorów, aby wprowadzić dwie krople w delikatny kontakt. Włącz falę trójkątną o częstotliwości 10 Hz i amplitudzie 10 mV oraz monitoruj odpowiedź prądu pojemnościowego w oprogramowaniu akwizycyjnym. Dostosuj obszar kontaktu kropli, lekko przesuwając elektrody, aż odpowiedź prądu pojemnościowego szczyt-do-szczytu na fali będzie między około 100 a 200 pikokouloubami.
Lub obszar kontaktu nie powinien być większy niż około 1/4 średnicy kropli. Poczekaj na samoistne utworzenie dwuwarstwy, co jest wskazane elektrycznie przez rozszerzającą się odpowiedź prądu szczyt-do-szczytu i optycznie przez rosnące odbijanie wewnętrzne o owalnym wyglądzie w regionie kontaktu. Potwierdź, że czyste dwuwarstwo lipidowe wyświetla prostokątne plateau prądu w odpowiedzi na stymulacji napięciowej trójkątnej, podczas gdy dwuwarstwo dopinane gramicydyną A wykazuje pochylone plateau, odbijając zespołową przewodzenie jonowe.
Gdy potwierdzi się stabilne odpowiedzi pojemnościowe lub przewodzące, wyłącz falę trójkątną i pozwól dwuwarstwie interfejsowej kropli wyrównać się przez co najmniej 15 minut przed zastosowaniem protokołów stymulacji. W oprogramowaniu do rejestracji wideo, ustaw częstotliwość klatek na co najmniej 20 klatek na sekundę. Wybierz odpowiednie ustawienia kamery i obiektywu.
Następnie kliknij Uzyskaj i wybierz Nowy Protokół. W zakładce Tryb akwizycji wybierz Stymulacja epizodyczna. Ustaw biegi na próbę i przebiegi na bieg na jedno.
Dostosuj czas trwania przebiegu do czterech sekund dłużej niż całkowita czasowa trwałość eksperymentu, pozwalając na dwu sekundową bazę przed i po stymulacji. Ustaw częstotliwość próbkowania między pięcioma a 10 kilohertzami. W zakładce Wejścia przypisz kanał rejestracji do obecnego wejścia.
A następnie, w zakładce Wyjścia, przypisz kanał stymulacji do wyjścia napięcia sterującego elektrodami. Otwórz zakładkę Forma fali. W kolumnie A, ustaw typ na Krok, pierwszy poziom i poziom delty na zero miliwoltów, a pierwszy
Niniejszy artykuł przedstawia protokół wykorzystania dwuwarstw interfejsowych kropel (DIBs) do badania właściwości elektromechanicznych membran lipidowych oraz lipidowo-peptydowych pod wpływem kontrolowanej stymulacji elektrycznej. Podejście to umożliwia pomiary przewodnictwa jonowego zarówno dla pojedynczych kanałów, jak i dla całych zespołów na dużych powierzchniach membran, co ułatwia szczegółową analizę deformacji błony oraz jej wpływu na peptydy przewodzące jony.
Kroplowe warstwy interfejsowe (DIBs) stanowią skalowalną i regulowaną platformę do charakteryzacji właściwości elektromechanicznych błon lipidowych oraz lipidowo-peptydowych, umożliwiając analizę funkcji kanałów jonowych na poziomie błony pod wpływem kontrolowanej stymulacji elektrycznej. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w wczesnej fazie walidacji celu oraz redukuje ryzyko związane z mechanizmami białek błonowych, co bezpośrednio wpływa na decyzje portfelowe w procesie odkrywania leków ukierunkowanych na kanały jonowe i błony. Możliwość systematycznej zmiany składu i środowiska błony zwiększa ciągłość translacyjną od etapu odkrywania po badania przedkliniczne.
Charakterystyka błon oparta na DIB wpisuje się w kontinuum od wczesnego etapu odkrywania do identyfikacji wiodących cząsteczek, stanowiąc pomost między testowaniem hipotez mechanistycznych a walidacją w modelach przedklinicznych.