Test ochrony amikacyny do ilościowego i wizualnego określenia Escherichia coli inwazji komórkowej

Skupiamy się na charakterystyce sposobu, w jaki przylegające inwazyjne E.coli naciekają komórki nabłonka jelitowego, oraz na identyfikacji czynników bakteryjnych przyczyniających się do tego procesu. Izolaty oporne na gentamycynę ograniczają możliwość stosowania tradycyjnych testów inwazyjności. Niniejszy protokół oparty na amikacynie umożliwia dokładną kwantyfikację bakterii wewnątrzkomórkowych.

Na początek należy przygotować wszystkie odczynniki i pożywki wymagane do testu inwazyjności. Następnie należy wyjąć z zamrażarki w temperaturze -80°C mrożony stok glicerolowy szczepu bakterii adherentno-inwazyjnej Escharicia colli (AIEC). Używając sterylnego drewnianego patyczka lub końcówki pipety, należy delikatnie zebrać bakterie z pętli i wysiać je metodą kreskową na płytkę z agarem Luria-Bertani (LB) w celu uzyskania pojedynczych kolonii.

Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez noc. Następnego dnia, używając sterylnego drewnianego patyczka lub końcówki pipety, wyizolować pojedynczą kolonię z płytki agarowej. Zaszczepić kolonię do 3 mL bulionu LB i inkubować kulturę w temperaturze 37 °C przy 200 obr./min przez noc.

Następnie wykonaj rozcieńczenie kultury nocnej w stosunku 1:10 w 1 mililitrze bulionu LB. Za pomocą spektrofotometru zmierz gęstość optyczną rozcieńczonej kultury przy 600 nanometrach. Przenieś 100 mikrolitrów kultury nocnej do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra i wiruj przy 6 000 G przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Ostrożnie odessaj nadsącz, aby nie naruszyć osadu komórkowego, a następnie zawieś osad w 1 milliliter medium pozbawionego surowicy oraz antybiotyków i leków przeciwgrzybiczych. Oblicz wymaganą objętość zawiesiny bakteryjnej, aby uzyskać wielokrotność infekcji (MOI) równą 10, korzystając z podanego wzoru. Aby przygotować medium do infekcji, przenieś obliczoną objętość zawiesiny bakteryjnej do sterylnej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 milliliter i uzupełnij objętość do 1 milliliter medium pozbawionego surowicy oraz antybiotyków i leków przeciwgrzybiczych.

Wymieszać delikatnie, pipetując ciecz w górę i w dół kilka razy. Przygotować płytkę 96-dołkową w celu oznaczenia jednostek tworzących kolonie na mililitr rozcieńczonej nocnej kultury bakteryjnej, wykonując dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne w sterylnym 1X PBS. Przenieść 200 µL rozcieńczonej nocnej kultury do pierwszego dołka płytki.

Pipetować 20 µL hodowli do kolejnego rzędu zawierającego 180 µL 1X PBS. Wymieszać, pipetując w górę i w dół 10 razy, i powtarzać proces rozcieńczania aż do uzyskania stężenia 10⁶, używając za każdym razem nowej końcówki do pipety. Następnie nanieść 10 µL rozcieńczeń punktowych w trzech powtórzeniach, z serii rozcieńczeń od 10² do 10⁶, na płytki LB z agarem.

Pozostaw plamki do czasu ich wchłonięcia przez agar w pobliżu płomienia. Inkubuj płytki przez noc w temperaturze od 27 do 30 °C, aby zapobiec nadmiernemu rozrostowi kolonii i uzyskać wyraźne, odizolowane kolonie. Wyjmij z inkubatora zdrowe konfluente monowarstwy nabłonkowych komórek Caco-2 hodowanych na 24-dołkowej płytce hodowlanej pokrytej kolagenem, a następnie odessaj pełną pożywkę z każdego dołka.

Do każdej dołka pipetujemy 1 ml surowicy i pożywki bez antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych. Pożywkę odsysamy, aby usunąć jej pozostałości, i powtarzamy płukanie jeszcze raz, tak aby łącznie przeprowadzić dwa płukania. Następnie do każdego dołka płytki 24-dołkowej z komórkami Caco-2 dodajemy 1 ml wcześniej przygotowanej pożywki do infekcji zawierającej AIEC.

Wiruj płytkę 24-dołkową z prędkością 500G przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby zsynchronizować kontakt bakterii z monowarstwą nabłonkową, a następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez trzy godziny, aby umożliwić inwazję bakterii. Przygotuj pożywkę zawierającą antybiotyk, dodając 240 µg/mL amikacyny do uprzednio ogrzanej pożywki z surowicą, wolnej od antybiotyków i przeciwgrzybiczych środków. Po okresie infekcji odessaj pożywkę z monowarstw komórek Caco-2 i przemyj każdy dołek 1 mL pożywki z surowicą, wolnej od antybiotyków i przeciwgrzybiczych środków.

Odssać pożywkę i powtórzyć płukanie jeszcze raz, aby łącznie przeprowadzić dwa płukania. Następnie do każdej studzienki pipetować 1 mL pożywki zawierającej 240 µg/mL amikacyny. Równolegle, w celu porównania, potraktować inny zestaw komórek 100 µg/mL gentamycyny i inkubować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 1 godzinę, aby wyeliminować bakterie zewnątrzkomórkowe.

Po inkubacji odessać medium z każdej studni. Dodać 1 milliliter PBS, aby wypłukać przylegające bakterie. Odessać PBS i powtórzyć płukanie jeszcze raz, tak aby łącznie przeprowadzić dwa płukania.

Następnie do każdej studni dodaj 200 µL 1% Triton X100 rozcieńczonego w PBS i inkubuj na wytrząsarce orbitalnej przy 90 obr./min przez 10 minut, aby zlizować komórki nabłonkowe. Przelej zawartość pipetą w górę i w dół około 30 razy na studnię, aby oddzielić komórki od płytki. Następnie wykonaj dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne lizatów komórkowych w płytce 96-dołkowej, używając PBS.

Nanieś 10 µL rozcieńczeń kropelkowych w trzech powtórzeniach, od nierozcieńczonego do rozcieńczeń 10³ , na płytki z agarem LB. Po wyschnięciu kropel inkubuj płytki przez noc w temperaturze od 27 do 30 °C, aby uzyskać wyraźne, pojedyncze kolonie. Po inkubacji wyjmij płytki i policz dobrze odizolowane kolonie z odpowiednich rozcieńczeń kropelkowych, które zawierają więcej niż siedem kolonii na kropelkę w powtórzeniach.

Na koniec, przy użyciu równań, oblicz ilość inokulum, liczbę odzyskanych jednostek tworzących kolonie na mililitr oraz procent inwazji. Leczenie gentamycyną lub amikacyną po zakażeniu monowarstw komórek Caco-2 inwazyjnym szczepem AIEC NRG857c lub nieinwazyjnym szczepem kontrolnym Escherichia coli DH5 alpha doprowadziło do podobnych profili inwazji. Wyniki te wykazały, że amikacyna była tak samo skuteczna jak gentamycyna w eliminowaniu bakterii zewnątrzkomórkowych i dokładnie odzwierciedlała wewnątrzkomórkowe obciążenie bakteryjne.

Leczenie gentamicinem izolatów klinicznych Escherichia coli opornych na gentamicin, pobranych od pacjentów z nieswoistymi zapaleniami jelit, skutkowało bardzo zmiennymi wartościami odzysku bakterii, wynoszącymi od około 21 do 2 788%. W przeciwieństwie do tego, traktowanie amikacyną drastycznie zredukowało odzysk bakterii we wszystkich izolatach, wykazując jej skuteczność i umożliwiając bardziej wiarygodne pomiary inwazji. Niniejszy protokół umożliwia dokładną kwantyfikację bakterii wewnątrzkomórkowych oraz ocenę inwazji bakteryjnej w komórkach nabłonkowych. Dodatkowe metody, takie jak mikroskopia immunofluorescencyjna, mogą zostać wykorzystane do dalszej weryfikacji inwazji bakteryjnej oraz potwierdzenia lokalizacji wewnątrzkomórkowej.

Przyszłe badania mogą pozwolić na zidentyfikowanie nowych czynników wirulencji oraz zbadanie szlaków gospodarza, które są celem podczas infekcji adherentnie inwazyjnymi E.coli.