Kwantyfikacja cytotoksyczności komórek NK potencjowanej przez chimeryczne receptory antygenowe i przeciwciała terapeutyczne z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek i cytometrii przepływowej

Nasze laboratorium bada rolę komórek NK (natural killer) w zdrowiu i chorobie, dążąc do wykorzystania ich potencjału w celu usprawnienia leczenia nowotworów litych oraz białaczek i chłoniaków. Istniejące testy cytotoksyczności komórek NK charakteryzują się brakiem standaryzacji między różnymi platformami i układami. Niniejszy protokół przedstawia powtarzalne metody obrazowania żywych komórek oraz cytometrii przepływowej w celu dokładnej oceny cytotoksyczności.

W celu rozpoczęcia przygotuj 10 ml 2x SYTOX Orange, rozcieńczając roztwór zapasowy SYTOX Orange w pożywce do hodowli NK-92 w 15-mililitrowej stożkowej probówce wirówkowej. Policz komórki docelowe za pomocą licznika Luna Counter po wymieszaniu z błękitem trypanowym lub zastosuj dowolną zwalidowaną metodę liczenia komórek opartą na wykluczaniu barwnika. Przenieś wymaganą liczbę komórek docelowych do 15-mililitrowej stożkowej probówki wirówkowej.

Wirować probówkę z prędkością 300G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie odrzucić nadsącz. Następnie zawiesić ponownie komórki docelowe do końcowego stężenia 250 000 komórek na mililitr w podłożu 2X SYTOX Orange. Aby przygotować komórki efektorowe, ocenić żywotność i stężenie komórek NK-92 i kontynuować procedurę tylko wtedy, gdy żywotność przekracza 80%, ponieważ niższa żywotność może wpłynąć na wyniki testu.

Należy odliczyć i przenieść wymaganą liczbę komórek NK-92 do poszczególnych probówek wirówkowych o stożkowym dnie o pojemności 15 ml. Po wirowaniu komórki należy zawiesić ponownie do końcowego stężenia 500 000 komórek na ml. Rozcieńczenia komórek efektorowych przygotowuje się poprzez dodanie 240 µL komórek efektorowych do dołków płytki 96-dołkowej o okrągłym dnie dla stosunku efektorów do celu 2:1, a do pozostałych dołków należy dodać 120 µL pożywki.

Przeprowadzić dwukrotne rozcieńczenia seryjne dla stosunków efektor do celu wynoszących odpowiednio 2:1, 1:1 oraz 0,25:1, mieszając zawiesiny poprzez co najmniej pięciokrotne pipetowanie i zmieniając końcówki między transferami. Następnie, w celu przygotowania kokultury, należy użyć 96-dołkowej płytki z płaskim dnem pokrytej polilizyną. Bezpośrednio przed transferem należy dokładnie resuspendować komórki celu i efektorowe, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza, a następnie dodać 100 µL każdej zawiesiny komórkowej do odpowiednich dołków.

Następnie do pozostałych nieużywanych studzienek dodaje się 200 µL PBS. Płytkę wiruje się z prędkością 100G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Następnie płytkę umieszcza się w systemie do obrazowania żywych komórek.

Należy pozyskiwać obrazy co jedną godzinę przez 24 godziny w temperaturze 37°C i przy 5% carbon dioxide. Po pierwszym skanowaniu należy zweryfikować jakość obrazu i w razie potrzeby dostosować ustawienia obrazowania. Należy przeprowadzić dekonwolucję spektralną (spectral unmixing), aby skorygować przenikanie sygnału SYTOX Orange do kanału zielonego.

Należy zweryfikować, czy pomarańczowe pozytywne martwe komórki nie zostaną błędnie zidentyfikowane jako komórki pozytywne dla koloru zielonego. Aby skonfigurować analizę poszczególnych komórek nieprzylegających, należy ustawić oczekiwaną średnicę obiektów na 15 micrometers, co odpowiada przybliżonej średnicy komórek. Czułość progu i czułość tekstury należy ustawić na wartość pięć, a czułość krawędzi na 10, aby ułatwić oddzielenie skupisk komórek.

Ustaw zakres filtra obszaru akceptowanych obiektów od 50 do 2 000 µm², aby wyeliminować zanieczyszczenia i duże obiekty. Ustaw maksymalną ekscentryczność na 0,95, aby wykluczyć obiekty niekomórkowe. Pozyskaj pierwotne ludzkie komórki NK hodowane przez 16 do 24 godzin.

Przenieś 500 000 komórek docelowych do 15 mililitrowej probówki wirówkowej z stożkowym dnem. Przepłucz komórki raz 10 mililitrami PBS. Wirowarkuj komórki przy 300G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie usunąć nadsącz. Przygotować 0,5 µM roztwór roboczy estru sukcynimidylowego karboksyfluoresceiny (CFSE) w PBS, rozcieńczając 1 µL 5 mM roztworu zapasowego CFSE w 10 mL PBS. Ponownie zawiesić otrzymany osad w roztworze CFSE w stężeniu około 1 mln komórek/mL.

Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 37 °C, owijając naczynie folią aluminiową w celu ochrony przed światłem. Następnie przerwać reakcję, dodając od pięciu do 10 objętości pożywki hodowlanej, i inkubować przez pięć minut w temperaturze 37 °C. Po odwirowaniu komórek, resuspender osad komórkowy do stężenia 250 000 komórek na mililitr, tak aby 100 µL zawierało 25 000 komórek.

Do odpowiednich dołków płytki 96-dołkowej z okrągłym dnem nanieś za pomocą pipety wielokanałowej 100 µL komórek docelowych na dołek. Każdy wariant doświadczalny przygotuj w trzech powtórzeniach. Następnie, dla każdego przeciwciała testowego oraz dopasowanej kontroli izotypowej, przygotuj 200 µL 4X roztworu przeciwciał w pożywce do hodowli komórek NK.

Przenieś roztwory przeciwciał do płytki głębokodołkowej. Do każdego dołka zawierającego komórki docelowe dodaj 50 µL roztworu przeciwciał i wymieszaj dokładnie, pipetując w górę i w dół co najmniej pięć razy. Do dołków kontrolnych bez przeciwciał dodaj 50 µL pożywki do hodowli komórek NK na dołek i wymieszaj dokładnie za pomocą pipety.

Inkubować płytkę przez 25 do 30 minut w standardowych warunkach inkubacji. Odliczyć i uzyskać 200 000 komórek NK i kontynuować procedurę tylko wtedy, gdy żywotność wynosi 75% lub więcej. Resuspender komórki do stężenia 250 000 komórek na mililitr w 800 µL pożywki do hodowli pierwotnych ludzkich komórek NK. Dodać 50 µL komórek NK do odpowiednich studni i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej pięć razy.

Następnie do studzienek kontrolnych pipetujemy po 50 µL pożywki hodowlanej i dokładnie mieszamy. Należy uważnie sprawdzić 96-dołkową płytkę z okrągłym dnem, aby potwierdzić, że wszystkie studzienki zawierają 200 µL cieczy, poziom menisku jest jednolity i nie ma pęcherzyków powietrza. Płytkę wirujemy przez dwie minuty przy 100G, a następnie inkubujemy przez 16 do 18 godzin w standardowych warunkach inkubacji.

Wiruj płytkę przez pięć minut przy 300G i odlej nadsącz. Przemyj wszystkie dołki, używając 200 µL na dołek buforu do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (bufor FACS). Przygotuj główną mieszaninę przeciwciał powierzchniowych w buforze FACS zgodnie z opisem przedstawionym w tym miejscu.

Ponownie zawiesić komórki w 50 µL na dołek mieszaniny głównej przeciwciał i dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej pięć razy. Inkubować płytkę przez 15 minut w temperaturze 4 °C, owiniętą w folię aluminiową w celu ochrony przed światłem. Dodać 150 µL na dołek buforu FACS.

Po wirowaniu ponownie zawiesić komórki w 100 µL na dołek 5 µM DAPI w buforze FACS. Niezwłocznie przystąpić do akwizycji w cytometrii przepływowej, pomijając inkubację przed pomiarem. Analizę cytometryczną przeprowadzić przy użyciu instrumentu Cytek Aurora, rejestrując kanały fluorescencji dla CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI oraz wszelkich dodatkowych fluoroforów.

Podczas kokultury komórki efektorowe, żywe komórki docelowe oraz martwe komórki wizualizowano za pomocą mikroskopii żywych komórek w czasie rzeczywistym. Komórki CAR2-NK-92 i CAR3-NK-92 wykazały szybszą kinetykę zabijania niż komórki CAR1-NK-92, szczególnie wyżej w wczesnych punktach czasowych przy równym stosunku efektorów do komórek docelowych. Zabijanie komórek docelowych wzrastało wraz z wyższymi stosunkami efektorów do komórek docelowych, w tym w przypadku kontrolnych komórek NK-92, które wykazały naturalną cytotoksyczność.

Komórki NK-92 CAR2 i CAR3 wykazały większą aktywność przy niższych stosunkach efektorów do komórek docelowych w późniejszych punktach czasowych. Jednocześnie w wcześniejszych punktach czasowych zaobserwowano zwiększoną aktywność przy pośrednich stosunkach efektorów do komórek docelowych. W celu ilościowego określenia aktywności komórek CAR-NK-92, kinetyki zabijania oraz ogólnej wydajności cytotoksycznej w populacjach efektorowych zdefiniowano trzy parametry: KR50, KT50 oraz IKI-50.

Samo dodanie daratumumabu nie zmniejszyło przeżywalności komórek docelowych, co potwierdziło, że przeciwciało nie miało bezpośredniego wpływu na żywotność komórek docelowych wobec braku komórek efektorowych. Współhodowla z samymi komórkami NK zmniejszyła przeżywalność komórek docelowych do około 70%, co wskazuje na bazową cytotoksyczność naturalną. Dodanie daratumumabu dodatkowo zmniejszyło przeżywalność komórek do około 37%, co jest zgodne ze zwiększoną cytotoksycznością zależną od przeciwciał.

W przeciwieństwie do tego, w warunkach z kontrolą izotypową odnotowano przeżywalność na poziomie około 62%, co było porównywalne z warunkiem zawierającym wyłącznie komórki NK. Degranulacja komórek NK była najniższa w kokulturze komórek NK i komórek docelowych bez przeciwciał, a najwyższa w warunku traktowanym daratumumabem, wynosząc około 31%, podczas gdy kontrola izotypowa wykazała pośredni poziom degranulacji na poziomie około 19%. Niniejszy protokół umożliwia badaczom ilościowe określenie naturalnej cytotoksyczności komórek NK, ocenę potencjału zabijania nowotworów przez konstrukty CAR-NK oraz porównanie skuteczności ADCC przeciwciał monoklonalnych. Kluczową kwestią podczas realizacji tego protokołu jest zachowanie dokładnego i spójnego liczenia komórek, pipetowania oraz wysiewania komórek NK i komórek docelowych, aby zapewnić wiarygodne i interpretowalne wyniki.

Przyszłe badania mogą wykorzystać te protokoły do badania mechanizmów unikania odpowiedzi immunologicznej przez komórki NK, porównywania podatności nowotworów oraz oceny nowych immunoterapii opartych na komórkach NK w różnych typach nowotworów.