Konstrukcja i implantacja systemu mikroinfuzyjnego do przedłużonego podawania czynników neuroaktywnych.

Witajcie, nazywam się Miles Cunningham. Wspólnie z Ryanem O'Connorem i Sydney Wong zaprezentujemy budowę systemu mikroinfuzji do ciągłego podawania czynników neuroaktywnych. Praca ta została wykonana w laboratorium rekonstrukcji neurologicznej w McLean Hospital, Harvard Medical School.

Pragniemy podziękować Fundacji Sydney rbe oraz Narsad za ich hojne wsparcie. Wykazaliśmy, że substancje neuroaktywne mogą być niezawodnie dostarczane do dyskretnych obszarów mózgu za pomocą wyciągniętej mikrokanuły szklanej borokrzemianowej o średnicy końcówki od pięciu do 10 razy mniejszej niż w przypadku konwencjonalnych kaniul doprowadzających. Na tym slajdzie przedstawiamy powszechnie stosowaną stalową kaniulę infuzyjną obok mikrokanuły, którą wykonaliśmy w naszym laboratorium.

Zmniejszenie rozmiaru kaniuli wprowadzającej przekłada się na gwałtowny spadek urazu w badanym obszarze mózgu. Wiele konwencjonalnych metod w rzeczywistości powoduje powstanie uszkodzenia w obszarze zainteresowania lub w jego obrębie, co poddaje w wątpliwość wiarygodność uzyskanych wyników. Na panelu A można zobaczyć zakres zaburzeń w obszarze lokalnym spowodowanych przez kaniulę o średnicy 0,32 mm w porównaniu z kaniulą o średnicy 50 µm widoczną na panelu B. Te zdjęcia przy małym powiększeniu przedstawiają preparaty świeże niebarwionych przekrojów Vibram.

Te same przekroje zostały następnie poddane barwieniu H&E i obrazowaniu przy większym powiększeniu. Aby dodatkowo zilustrować zmniejszenie uszkodzeń tkanek przy użyciu mikrokanuli, przedstawiono komponenty systemu mikoinfuzji: pompę zet mini Osmo z wykonowanym ze stali nierdzewnej modulatorem przepływu, w którym usunięto kołnierz. Wykorzystano dwa do trzech centymetrów rurki polietylenowej, mikrokanulę borokrzemową wykonaną na zamówienie oraz drut prowadzący o rozmiarze 28 G; tak wygląda złożony system mikoinfuzji gotowy do implantacji.

Do stworzenia mikrokanul o pożądanych specyfikacjach wykorzystano tutaj standardowy pionowy polaryzator pipetowy. Odpowiednie są również polaryzatory poziome. Rurkę borokrzemową ustawia się i stabilizuje poprzez regulację temperatury elementu grzejnego oraz napięcia polaryzatora.

Można niezawodnie wytwarzać mikrokanule o określonych średnicach i długich, zwężających się łącznikach trzpienia. Rurka krzemionkowa Bora jest podgrzewana, a następnie przykłada się delikatny nacisk, aby uzyskać pożądany stopień zgięcia rurki. Zgięcie to wykonuje się w odległości od końcówki mikrokanuli dostosowanej do głębokości docelowego obszaru mózgu, z uwzględnieniem odstępu nad czaszką.

Końcowa długość tej rurki dystalnej mikrokaniuli, w miejscu zgięcia, wynosi około 9–10 mm. Pozornie niezadowolony z uzyskanego wyniku, Ryan ponownie wprowadza mikrokaniulę, aby dokonać precyzyjnej korekty i dopracować kąt zgięcia w tym miejscu.

Użycie ołówka diamentowego daje znacznie lepszy efekt. Sydney demonstruje metodę przecinania rurki z borokrzemianu około 5 mm proksymalnie od zagięcia, mocno dociskając rurkę do twardej powierzchni tak, aby dystalna część mikrokanuły swobodnie zwisała poza krawędź. Następnie wykonuje nacięcie obwodowe rurki.

Następnie, wywierając delikatny nacisk, odłamuje ona rurkę wzdłuż naciętego łączenia. Cienką, przezroczystą końcówkę kaniuli można następnie zabarwić niezmywalnym tuszem, aby ułatwić jej wizualizację. Podczas operacji z powiększeniem, końcówka mikrokaniuli zostaje przycięta nożyczkami do mikrodysekcji do pożątej średnicy.

Średnicę końcówki można potwierdzić za pomocą okularu lub mikroskopu. Druty do wyrównania promieniowego przygotowuje się z drutu ze stali nierdzewnej o grubości 28 gauge, pociętego na odcinki o długości około trzech centymetrów. Następnie za pomocą pęsety wykonuje się na końcu każdego drutu mały haczyk o średnicy około dwóch milimetrów.

Druty do wyrównywania umieszcza się w szalce Petriego wraz z odcinkami rurek polietylenowych o długości od dwóch do trzech centymetrów w mikrokanulach. System mikroinfuzyjny można zbudować przy użyciu instrumentów powszechnie dostępnych w większości laboratoriów. Mikropincety, konwencjonalne pęsety, nożyczki chirurgiczne i kleszczyki hemostatyczne umieszcza się w polu chirurgicznym w celu sterylizacji.

Instrumenty, elementy systemu mikrowlewowego oraz kilka arkuszy folii aluminiowej są sterylizowane w standardowej autoklawie. Modulator przepływu zostaje ostrożnie wyjęty z opakowania i umieszczony w sterylnym szalce Petriego. Jest on stabilnie utrzymywany za pomocą kleszczyków hemostatycznych, a plastikowy kołnierz zostaje usunięty z nierdzewnej stalowej rurki modulatora za pomocą nożyczek.

Miniaturową pompę osmotyczną również wyjmuje się z opakowania i umieszcza w sterylnej szalce Petriego. Rurkę ze stali nierdzewnej wprowadza się do rurki polietylenowej na około dwa do trzech milimetrów, a następnie obie są ze sobą uszczelniane za pomocą epoksydu aktywowanego światłem. Do precyzyjnych prac używamy spoiwa Lummi bond z mojego laboratorium neurologicznego; napełniamy strzykawkę o pojemności 1 CC spoiwem Lummi bond i używamy igły 27 G jako aplikatora; pod silnym światłem Lumon utwardza się w zaledwie kilka sekund.

Miniaturową pompę osmotyczną napełnia się, trzymając ją w pozycji pionowej i ostrożnie wstrzykując płyn za pomocą igły do napełniania dostarczonej przez producenta. Zaleca się monitorowanie objętości płynu wstrzykiwanego do pompy lub ważenie pompy przed i po napełnianiu, aby upewnić się, że pompa została całkowicie wypełniona i nie jest wadliwa. Należy pamiętać, że nie zalecamy ponownego wykorzystywania pomp.

Następnie cały modulator z przymocowaną rurką polietylenową zostaje umieszczony wewnątrz mini pompy osmotycznej. Płyn znajdujący się w pompie zostanie wtłoczony do rurki polietylenowej podczas wsuwania piankowego modulatora. Należy odnotować początkową długość rurki polietylenowej wypełnionej płynem; powinno się zaobserwować jej zwiększenie po aktywacji pompy podczas inkubacji w sterylnym roztworze soli fizjologicznej w temperaturze 39 °C po 12 h inkubacji.

Aktywowaną mini pompę osmotyczną zanurza się w sterylnej soli fizjologicznej, co zapewnia środowisko wolne od powietrza dla końcowych etapów konstrukcji systemu mikroinfuzji. Strzykawka wyposażona w plastikową cewkę o małej średnicy i wypełniona tym samym roztworem, który znajduje się w pompie, służy do usunięcia powietrza z niezatkanej części cewki polietylenowej. Należy zwrócić uwagę, aby usunąć również powietrze z mikrokanuli.

Podobnie, dystalny koniec rurki polietylenowej może wymagać rozszerzenia za pomocą mikropincety, po czym wprowadza się proksymalny koniec mikrokaniuli. Cały układ jest teraz wolny od powietrza i przestrzeni martwej, można go zatem wyjąć z kąpieli solnej i osuszyć sterylną gazą. Następnie nanosi się Luma bond, aby przymocować mikrokaniulę do rurki polietylenowej. Aby zmniejszyć szybkość przepływu mini pompy osmotycznej o około połowę, do małej szalki Petriego wlewa się sterylną gorącą parafinę, a następnie krótko zanurza w niej proksymalną połowę mini pompy osmotycznej.

Nadmiar parafiny należy odsączyć, a system do mikroinfuzji umieścić ponownie w sterylnej soli fizjologicznej i przechowywać do czasu operacji. Tuż przed implantacją chirurgiczną drut prowadzący zostaje przymocowany do zagięcia mikrokanuli.

Oś podłużna drutu prowadzącego jest wyrównana z częścią mikrokaniuli, która zostanie wprowadzona do tkanki mózgowej, i jest utrwalona lumonem w tej pozycji. Następnie system mikroinfuzji można umieścić na manipulatorze urządzenia stereotaktycznego.

Drut prowadzący jest mocowany za pomocą zacisku ramienia manipulatora, a pompa jest przywiązana od góry pętlą z jałowej nici chirurgicznej. Pozwoli to na podtrzymanie jej ciężaru i umożliwi idealne ustawienie mikrokaniuli prostopadle do powierzchni czaszki poprzez ostrożne wygięcie drutu prowadzącego pęsetą; następnie system mikroinfuzji można zaimplantować zgodnie ze standardową procedurą stereotaktyczną. Przewód boel jest mocowany do powierzchni czaszki za pomocą kleju.

Używamy materiału den mat Jaron do uformowania niskiego postumentu. Nadmiar drutu prowadzącego wystający ponad miejsce przygotowania zostaje następnie odcięty równo z powierzchnią postumentu. Za pomocą tarczy tnącej zamocowanej do wiertarki o wysokich obrotach, mini pompa osmotyczna może zostać następnie umieszczona podskórnie w obrębie łopatki zwierzęcia.

Przedstawiona metoda oferuje szereg zalet w porównaniu z tradycyjnymi technikami. Może być ona dostosowana do gatunku i wieku zwierzęcia doświadczalnego. Krzemionkowe rurki można ukształtować tak, aby przylegały do powierzchni czaszki zwierzęcia.

Dzięki temu, umożliwiając stabilną fiksację o niskim profilu i eliminując potrzebę stosowania dużego postumentu czaszkowego, rana chirurgiczna może zostać łatwo zamknięta nad opływowym postumentem do mikroinfuzji, co zmniejsza ryzyko infekcji oraz dyskomfort zwierzęcia, a przymocowanie systemu do czaszki wymaga mniejszej powierzchni. W związku z tym dodatkowe lub kolejne procedury mogą być wykonywane bez zakłóceń spowodowanych przez większy postument. Co najważniejsze jednak, metoda ta zmniejsza inwazyjność i uraz środowiska lokalnego w miejscu infuzji, minimalizując tym samym efekt obserwatora.

Są to zmiany, jakie aktywna obserwacja wywołuje w obserwowanym zjawisku.