Badanie aktywności kompleksów mitochondrialnych w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

Mitochondria pełnią liczne role w fizjologii komórki, od metabolizmu i produkcji energii, przez programowaną śmierć komórki, aż po syntezę hormonów steroidowych. Pomimo znaczenia mitochondriów zarówno w podstawowych funkcjach komórkowych, jak i w patogenezie chorób, niewiele wiadomo o ich funkcji w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych oraz ich zróżnicowanym potomstwie. W tym filmie pokażemy, w jaki sposób kompleksy łańcucha oddechowego mitochondriów w ludzkich komórkach macierzystych można analizować za pomocą testów aktywności Ingel.

Witajcie, nazywam się Ivan OV i pracuję w laboratorium Michaela Tetela w Katedrze Patologii i Medycyny Laboratoryjnej na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę oceny funkcji kompleksów oddechowych mitochondriów w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych. Ta procedura oceny aktywności w żelu obejmuje izolację surowych frakcji mitochondrialnych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, rozdział kompleksów mitochondrialnych układu fosforylacji oksydacyjnej za pomocą wysokorozdzielczej przejrzystej natywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym oraz późniejszy pomiar aktywności w żelu.

Zacznijmy zatem. Pierwszym krokiem w tej procedurze jest wyizolowanie mitochondriów z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. W tym badaniu wykorzystamy ludzkie embrionalne komórki macierzyste hodowane na płytce pokrytej matrigelem w warunkach bez użycia komórek dokarmiających.

Aby wyizolować mitochondria z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, zaczynamy od ich przemycia ciepłym 1x PBS pH 7,4, a następnie poddajemy komórki trypsynizacji przez pięć minut. W płytce 6-dołkowej można zastosować 1 ml trypsyny 1x na każdą studzienkę. Po pięciu minutach reakcję można zatrzymać, dodając równą objętość świeżego inhibitora trypsyny o stężeniu 1 mg/ml w 1x PBS, a następnie zebrać komórki.

Zebrane komórki należy następnie odwirować z prędkością 200 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu należy odlać nadsącz i resuspender osad komórkowy w 0,8 do 1,7 mililitra lodowatego buforu do izolacji mitochondriów z dodaniem świeżo przygotowanego koktajlu inhibitorów proteaz 1×. Ilość użytego buforu zależy od wielkości otrzymanego osadu komórkowego. Po resuspensji osadu należy inkubować go na lodzie przez około 10 minut.

Po inkubacji rozbijamy komórki za pomocą homogenizatora; może to wymagać od 40 do 50 pociągnięć. Możemy sprawdzić, czy proces homogenizacji został zakończony, barwiąc alikwot komórek DOD błękitem trypanowym i obserwując go pod mikroskopem świetlnym. Powinno to wyglądać mniej więcej w ten sposób.

Jest to pierwsze ujęcie po 50 przesunięciach tłoka. Jest to drugie ujęcie po 80 przesunięciach tłoka. Po homogenizacji komórek odwiruj je przy 20 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. W ten sposób otrzymamy surowy osad mitochondrialny, który będzie zawierał również jądra komórkowe i większe fragmenty komórek.

Przed zebraniem osadu należy zważyć probówkę do zbierania w celu oszacowania późniejszej masy osadu, odlać i usunąć nadsącz, a następnie zważyć wytrącony surowy osad mitochondrialny. Po odjęciu masy probówki na tym etapie można przystąpić do solubilizacji osadu, co zostanie przedstawione w następnym kroku. Aby zsolubilizować surowy osad mitochondrialny, należy w pierwszej kolejności utrzymać osad w lodzie i wymieszać go na wortexie z 35 µL lodowatego buforu do solubilizacji.

W przypadku każdych 20 mg osadu, szczegółowe informacje dotyczące składników buforu znajdują się w towarzyszącym protokole pisemnym. Po wymieszaniu w wortexie i dodaniu buforu do solubilizacji, a przed dodaniem digitoniną, przenosimy resuspendowany osad do probówki odpowiedniej do wirowania przy wysokich prędkościach, a następnie dodajemy 20 µL 10% (w/v) digitoniny na 20 mg masy osadu i mieszamy, lekko uderzając w probówkę. Po dokładnym wymieszaniu inkubujemy osad mitochondrialny przez 5 do 10 minut na lodzie. W celu solubilizacji białek zamiast digitoniny można zastosować dodecylosiarczan sodu (DDM) lub Triton X 100.

Wybór detergentu oraz jego ilość mogą wpływać na powstawanie suprakompleksów lub form multimerycznych kompleksów mitochondrialnych po inkubacji w lodzie. Po upłynnieniu osadu odwirujemy go przy 100 000 ×g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, a następnie pobierzemy klarowny nadsącz. Teraz możemy przygotować nadsącz do naniesienia na żel gradientowy w celu przeprowadzenia natywnej elektroforezy gradientowej mitochondriów.

Zalecamy stosowanie żelu gradientowego akrylamidowego od 5 do 13% z żelem nakładającym 3,5%. Do przygotowania żelu wykorzystamy mieszaninę akrylamidu i bis-akrylamidu zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Roztwór akrylamidu i bis-akrylamidu przygotowuje się z wyprzedzeniem i przechowuje w temperaturze 4 °C w ciemnym miejscu.

Akrylamid i bisakrylamid to toksyczne substancje chemiczne, zarówno w formie proszku, jak i w formie ciekłej, dlatego podczas pracy z nimi należy zachować szczególną ostrożność. Mieszamy roztwór akrylamidu i bisakrylamidu z aalikwotem trzykrotnego buforu do żelu, składającego się z 1,5 molarnego kwasu 6-aminocyksoheksanowego oraz 75 milimolarnego TEMED w pH 7,0. Ilość roztworu akrylamidu i bisakrylamidu dodawana do buforu zależy od procentowej zawartości żelu, którą przygotowujemy w celu stworzenia żelu gradientowego.

Przygotujemy jedną mieszaninę 4% i jedną mieszaninę 13%, natomiast żel koncentrujący będzie mieszaniną 3,5%. Należy pamiętać o dodaniu glicerolu do mieszaniny 13%. Po przygotowaniu wszystkich trzech mieszanin dodajemy do nich odpowiednią ilość siarczanu amonu i TEMED, a następnie wlewamy mieszaniny do komory odlewniczej do tworzenia gradientu.

Lewa część komory zawiera mieszaninę 5%. Prawa część komory zawiera mieszaninę 13% z niewielkim magnetycznym mieszadłem. Przystępujemy do wlewania żelu poprzez otwarcie prawej części komory.

Następnie natychmiast otwieramy lewą część komory i pozwalamy, aby roztwór 5% wymieszał się z roztworem 13%, tworząc gradient. Dodajemy niewielką ilość izopropanolu na górną powierzchnię żelu, aby po polimeryzacji uzyskać ostrą, prostą krawędź żelu. Około godziny później, gdy polimeryzacja żelu gradientowego zostanie zakończona, usuwamy izopropanol, wlewamy do urządzenia żel nakładający 3,5% i wkładamy grzebień do żelu.

Żele będziemy składać i prowadzić w pomieszczeniu chłodniczym o temperaturze od około czterech do siedmiu stopni Celsjusza. Do prowadzenia tego żelu użyjemy dwóch różnych buforów. W komorze anodowej zastosujemy bufor zawierający 25 millimolar ole kwasu solnego o pH 7,0.

Bufor katodowy będzie zawierać 50 mM Tris, 7,5 mM kwasu solnego, 0,02% (m/v) n-dodecyl-β-D-maltozydu (DDM) oraz 0,05% (m/v) deoksycholanu sodu o pH 7,0. Aby przygotować supernatant do nałożenia na właśnie przygotowany żel, dodaje się bufor do prób, aby uzyskać końcowe stężenie 5% (m/v) glicerolu i 0,01% (m/v) Ponto S; zazwyczaj dodajemy 10-kroć roztwór zapasu zawierający glicerol i Ponto S bezpośrednio do supernatantów.

Teraz możemy przystąpić do naniesienia próbki na żel. Do poszczególnych studzienek żelu naniesiemy objętość zawierającą od 20 do 40 miligramów surowego białka mitochondrialnego na każdą ścieżkę. Bezpośrednio po naniesieniu próbki, elektroforezę prowadzimy przy napięciu 100 V.

Po przedostaniu się próbki do żelu koncentrującego napięcie można zwiększyć do 500 V, ograniczając natężenie prądu do 15 mA. Chociaż zazwyczaj przeprowadzamy elektroforezę przez noc przy napięciu od 70 do 100 V, przerywamy ten proces, gdy wyraźna linia czerwonego barwnika zos zbliży się do czoła żelu. Po zakończeniu elektroforezy możemy analizować aktywność różnych kompleksów białkowych bezpośrednio w żelu.

Czas inkubacji dla każdego testu zależy od wydajności solubilizacji białek oraz ilości materiału naniesionego do każdego dołka. Kompleksy pierwszy, czwarty i piąty zazwyczaj dają silniejsze sygnały niż kompleksy drugi i trzeci. Z tego powodu czas barwienia dla kompleksu drugiego i trzeciego powinien być dłuższy.

Aby przetestować aktywność kompleksów, konieczne będzie zastosowanie specyficznych buforów dla każdego z nich. Skład poszczególnych buforów znajduje się w protokole pisemnym. Teraz wytniemy poszczególne ścieżki żelu, aby oddzielnie przeprowadzić testy aktywności in gel.

W przypadku wszystkich kompleksów, z wyjątkiem kompleksu piątego, należy inkubować wycinek żelu w odpowiednich buforach przez kilka godzin w temperaturze pokojowej. Po inkubacji utrwalono żel w 50% metanolu i 10% kwasie octowym przez 15 do 45 minut. Utrwalony żel przechowuje się w 10% kwasie octowym.

Tutaj widać, jak wygląda barwienie kompleksu I. W plastrze żelu widoczny jest jeden głęboko purpurowy prążek odpowiadający kompleksowi I. Przejrzyste żele umożliwiają wykonanie densytometrii aktywności kompleksów mitochondrialnych i przeprowadzenie analiz porównawczych.

Po gęstej cytometrii zazwyczaj suszymy plastry żelu w celu długoterminowego przechowywania lub skanowania, aby uzyskać wysokiej jakości obraz kompleksu dwa, który barwi się na ten sam kolor fioletowy co kompleks trzy i kompleks cztery. Oba dają pomarańczowy lub żółtawy prążek barwienia. Oto przykłady aktywności barwienia dla kompleksów dwa, trzy i cztery.

Właśnie pokazaliśmy, jak analizować aktywność kompleksów oksydacyjnych mitochondrialnych, które zostały wyektrahowane z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i rozdzielone za pomocą metody o wysokiej rozdzielczości, w tym elektroforezy w żelu natywnym. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentu.