Protokół izolacji neutrofili

Protokół izolacji neutrofili. Procedura ta służy do wydzielenia leukocytów z próbki krwi pełnej przy użyciu wirówki i probówek. Mieszadło wortex, igła i strzykawka, filtr strzykawkowy.

Materiały marki Milli pore MX gv 0,22 Mikrometra. Separacja neutrofili w roztworze soli Hanksa wymaga dwóch rodzajów roztworów HBSS. HBSS z chlorkiem wapnia zostanie użyty do przygotowania roztworu z albuminą surowicy ludzkiej.

HBSS bez chlorku wapnia zostanie użyty do zawieszenia i przemywania neutrofili. Należy zachować szczególną ostrożność, aby w tej procedurze użyć odpowiedniego roztworu HBSS. Albumina surowicy ludzkiej lub HSA to białko w osoczu krwi, które utrzymuje pH i ciśnienie osmotyczne.

Nie należy używać buforu do lizy czerwonych krwinek z amalgamatem surowicy bydlęcej. Produkt ten jest wytwarzany przez Roche Diagnostics, neutrophil Isolation Media NIM Cedar Line Labs Lymph light Poly separation media; należy chronić go przed światłem i przechowywać w lodówce, aby uzyskać najlepsze wyniki. Wszystkie odczynniki powinny mieć temperaturę pokojową w momencie użycia.

Wyjąć odczynniki z lodówki na godzinę przed rozpoczęciem eksperymentu. Przygotować roztwór H-B-S-S-H-S-A do separacji neutrofili. Pipetować HBSS z chlorkiem wapnia do fiolki.

Naciągnąć HSA do strzykawki. Należy unikać uwięzienia pęcherzyków powietrza. Zdjąć igłę ze strzykawki i zastąpić ją filtrem.

Wstrzyknij HSA przez filtr do fiolki z HBSS, wymieszaj w wortexie; gdy pozostałe materiały będą przygotowane i doprowadzone do temperatury pokojowej, pobierz około 15 ml krwi pełnej. Pozwoli to na uzyskanie od 10 do 15 ml zawiesiny neutrofili o stężeniu 10⁸. Dawca nie powinien spożywać alkoholu ani przyjmować leków dostępnych bez recepty na 24 godziny przed pobraniem próbki krwi.

Mogą one zakłócić proces separacji. Krew pełną można przeciwzakrzepić za pomocą EDTA, cytrynianu lub heparyny, dodając dziewięć części krwi do jednej części K3EDTA, cytrynianu sodu lub heparyny zgodnie z instrukcjami producenta. W niniejszej procedurze opisane zostaną następujące kroki.

Oddziel i usuń osocze oraz monocyty. Oddziel i pobierz warstwę neutrofili, lizując erytrocyty w celu uzyskania zawiesiny neutrofili po pierwszej separacji. Pobierz neutrofile z warstwy NIM.

Do probówki wirówkowej należy zebrać pięć mililitrów medium do izolacji. Umieszczenie medium do izolacji w dolnej części probówki pozwala mu pełnić funkcję filtra, ponieważ wirówka będzie wymuszać przepływ krwi w dół przez medium. Ostrożnie nanieś warstwę pięciu mililitrów krwi na NIM, aby zapewnić czystą separację.

Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie dopuścić do zmieszania roztworów. Ten krok należy przeprowadzać powoli i starannie, trzymając końcówkę pipety blisko powierzchni medium rozdzielczego, aby zapobiec wymieszaniu. Wirować roztwór przy 500 RCF przez 35 minut.

W temperaturze od 20 do 25 °C krew powinna rozdzielić się na sześć wyraźnych warstw. Są to: osocze, monocyty, medium izolacyjne, neutrofile, kolejna warstwa medium izolacyjnego oraz pellet czerwonych krwinek na dnie. Jeśli te sześć warstw nie jest wyraźnych i odrębnych, proces separacji nie przebiegł prawidłowo i należy go powtórzyć.

Do częstych przyczyn nieprawidłowej separacji należą: przeterminowane medium do izolacji, spożycie alkoholu przez dawcę w ciągu ostatnich 72 godzin lub przyjmowanie przez dawcę innych leków, takich jak Tylenol lub aspiryna. Ostrożnie usuń i odrzuć frakcję monocytów osocza oraz medium do izolacji. Umieść te warstwy w szczelnej probówce i zutylizuj; następnie ostrożnie pipetuj warstwę neutrofili oraz całe medium do izolacji znajdujące się pod neutrofilami do czystej probówki wirówkowej, aby odzyskać jak największą liczbę neutrofili.

Często najprościej jest pobrać również nieco medium izolacyjnego z warstwy poniżej. Nie zakłócaj osadu na dnie. Kolejny krok: oczyszczanie warstwy neutrofili.

Rozcieńczyć roztwór neutrofili do 10 ml za pomocą HBSS bez wapnia. Kilka razy odwrócić probówkę, aby zawiesić komórki, a następnie odwirować roztwór neutrofili.

350 RCF przez 10 minut. W temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza na dnie probówki powinien znajdować się czerwony osad zawierający neutrofile i pozostałe erytrocyty. Usunąć nadsącz za pomocą pipety.

Należy zachować ostrożność, aby nie naruszyć osadu na dnie podczas lizy erytrocytów.

Krwinki czerwone w próbce muszą teraz zostać zniszczone poprzez lizę. Aby przeprowadzić lizę pozostałych krwinek czerwonych, dodaj do probówki z osadem dwa mililitry buforu do lizy erytrocytów. Resuspenduj osad, mieszając fiolkę na wirówce typu vortex przy ustawieniu od trzech do czterech.

Należy unikać zwiększania ustawień wirówki vortex powyżej poziomu cztery, ponieważ może to doprowadzić do aktywacji neutrofili. W celu rozpuszczenia osadu może być konieczne mieszanie w vortexie przez kilka sekund lub stosowanie trybu pulsacyjnego. Wirować roztwór lizujący z prędkością 250 RCF przez pięć minut.

Użyj opcji miękkiego startu (soft start), aby zminimalizować uszkodzenia próbki. Usuń nadsącz za pomocą pipety. Powtórz proces lizy.

W razie potrzeby, aby uwolnić zawiesinę neutrofili, dodać 500 µL HBSS bez wapnia do każdej probówki. Przewirrować osad na ustawieniu od trzech do czterech, rozcieńczyć do 10 mL za pomocą HPSS bez wapnia i odwirować. Neutrofile wirować przy 250 RCF przez pięć minut, a następnie odessać i usunąć nadsącz.

Osad resuspendować w 250 µL roztworu HBSS z HSA; zazwyczaj zbiera się 2 × 10⁶ neutrofili na ml.