Trypsynizacja i pasażowanie komórek ssaczych

Technologia hodowli tkankowej znalazła szerokie zastosowanie w dziedzinie biologii komórki. Jednakże hodowane komórki wymagają regularnej pielęgnacji, aby zachować żywotność. Gdy komórki osiągną pełną konfluencję, muszą zostać poddane subkulturze lub pasażowaniu.

Zaniechanie tych czynności prowadzi do ograniczenia wzrostu, a w konsekwencji do śmierci komórek. W tym filmie demonstrujemy, jak utrzymywać hodowle komórkowe zarówno w przypadku linii komórkowych adherentnych, jak i zawiesinowych. Cześć, jestem Ricky z laboratorium dr. LAN w sieci Molecular Pathology Laboratories w East Tennessee.

Dzisiaj chcę przedstawić dwie techniki pasażowania komórek zawiesinowych oraz komórek przylegających. Aby przeprowadzić pasaż komórek z płytki, zaczniemy od hodowli pierwotnej, która osiągnęła pełną konfluencję w 60 mm szalce Petriego lub 25 cm² flasku do hodowli tkanek zawierającym 5 ml medium do hodowli tkanek.

Zaczynamy od usunięcia całej pożywki z hodowli pierwotnej za pomocą sterylnej pipety. Następnie przemywamy przylegającą monowarstwę komórek raz lub dwa razy niewielką objętością HBSS bez wapnia i magnezu o temperaturze 37 °C. Ma to na celu usunięcie pozostałości płodowej surowicy bydlęcej, która mogłaby hamować działanie enzymu trypsyny dodawanego w kolejnym kroku.

Następnie dodaj do hodowli odpowiednią ilość ciepłego roztworu trypsyny z EDTA, aby pokryć przyrastającą warstwę komórek. Następnie płytkę można umieścić na podgrzewaczu o temperaturze 37 °C na jedną do dwóch minut. Po inkubacji ostukać dno płytki o płaską powierzchnię, aby odczepić komórki.

Sprawdź hodowlę pod mikroskopem odwróconym, aby upewnić się, że komórki stały się okrągłe, co wskazuje na ich odklejenie się od powierzchni. Jeśli komórki nie odkleiły się w wystarczającym stopniu, wprowadź płytkę z powrotem do ogrzewacza na dodatkową minutę lub dwie. Po oględzinach pod mikroskopem wypłucz naczynie w pełnej pożywce i przelej zawiesinę pipetą do 15 ml probówki stożkowej zawierającej 2 ml pełnej pożywki.

Odwiruj komórki, aby otrzymać osad, a następnie resuspenduj go w pożywce kompletnej. Następnie dodaj równą objętość zawiesiny komórkowej do każdej z nowych, odpowiednio oznakowanych płytek. Alternatywnie komórki można policzyć za pomocą komory udowania i rozcieńczyć do pożądanej gęstości, aby do każdej płytki dodać określoną liczbę komórek.

Należy pamiętać, aby opisać każdą płytkę datą subkultury oraz numerem pasażu. Po dodaniu zawiesiny komórek, dodaj 1 ml świeżej pożywki do każdej nowej kultury. Następnie inkubuj płytki w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37°C i 5% CO2.

Po inkubacji komórek przez noc, należy dodać do płytek świeżą pożywkę i ponownie umieścić je w temperaturze 37 stopni. Gdy komórki na płytce osiągną pełną konfluencję, można przeprowadzić ponowne pasażowanie, powtarzając tę procedurę i kontynuując pasażowanie w razie potrzeby. Teraz pokażemy, jak pasażować komórki w hodowli zawiesinowej.

Pakowanie komórek w hodowli zawiesinowej jest prostsze niż w przypadku komórek adherentnych. Przed pakowaniem hodowli zawiesinowych komórki muszą być utrzymywane poprzez dokarmianie co dwa do trzech dni, aż osiągną konfluencję, czyli moment, w którym komórki skupiają się w zawiesinie, a medium staje się mętne podczas zakręcania kolby.

Aby to zrobić, wyjmij kolbę z zawiesiną komórek z inkubatora, uważając, aby nie zakłócić tych, które osiadły na dnie kolby. Aseptycznie usuń i odrzuć około jednej trzeciej pożywki z kolby, a następnie zastąp ją równą objętością uprzednio ogrzanej pożywki w temperaturze 37 °C. Po wymianie pożywki delikatnie zakręć kolbą i przenieś ją z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.

Jeśli w kolbie znajduje się mniej niż 15 ml pożywki, należy inkubować ją w pozycji poziomej, aby zwiększyć kontakt komórek z pożywką. W przeciwnym razie kolbę można inkubować pionowo w dniach, w których nie przeprowadza się dokarmiania kultur. Należy sprawdzać je, delikatnie obracając kolby w celu resuspensji komórek.

Należy zwrócić uwagę na wszelkie zmiany koloru pożywki, które świadczą o prawidłowym wzroście metabolicznym. Po osiągnięciu konfluencji kultur, co powinno nastąpić przy około 2,5 miliona komórek na ml, można przeprowadzić pasaż. W ten sposób zaprezentowaliśmy metodę pasażowania hodowlach komórek zarówno w formie przylegającej, jak i zawiesiny.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia we wszystkich eksperymentach.