Analiza immunoblottingowa

Imunoblotting, często nazywany Western blottingiem, jest wykorzystywany do identyfikacji w próbce białek specyficznych antygenów rozpoznawanych przez przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne. Procedura ta zazwyczaj następuje po elektroforezie żelowej w jednym lub dwóch wymiarach i polega na przeniesieniu rozdzielonych białek na błony nitrocelulozowe. Następnie błony te inkubuje się z przeciwciałami pierwotnymi i wtórnymi, bezpośrednio lub pośrednio sprzężonymi z enzymami, a następnie wizualizuje antygeny białkowe na błonach, wykorzystując barwne lub fluorescencyjne reakcje substratowe.

W tym filmie przedstawiamy krok po kroku procedurę immunoblottingu. Dzień dobry, nazywam się Sean Gallagher z UVPI i współpracuję z centrum proteomiki tutaj, w KE Graduate Institute. Dzisiaj zaprezentuję Państwu analizę immunoblottingu.

Proces ten obejmuje szereg etapów, w tym rozdział białek, ich transfer na membrany (blotting), sondowanie immunologiczne oraz wizualizację z wykorzystaniem substratów chromogennych i chemiluminescencyjnych. Zacznijmy zatem. Przed rozpoczęciem procedury immunoblottingu, próbki białek muszą zostać najpierw rozdzielone metodą elektroforezy przy użyciu żeli jednowymiarowych lub dwuwymiarowych o rozmiarze małym lub standardowym.

Przygotować próbki antygenowe i nałożyć je na ścieżki żelu, uwzględniając w jednej lub kilku ścieżkach białko wstępnie barwione lub biotynylowane oraz standardy masy cząsteczkowej. Markery białkowe te zostaną przeniesione na membranę, co pozwoli w wygodny sposób określić orientację membrany oraz wielkości białek po immunobarwieniu. Po zakończeniu elektroforezy można przystąpić do przygotowania immunoblottu.

Aby przygotować do immunoblotingu, najpierw rozdziel żel z ramki i usuń żel koncentrujący. Inkubuj żel przez 30 minut w temperaturze pokojowej w buforze do transferu; taka równowaga jest niezbędna, aby zapobiec zmianie rozmiaru żelu podczas transferu. W czasie równoważenia żelu rozpocznij montaż kanapki transferowej w kuwecie wystarczająco dużej, aby pomieścić plastikową kasetę transferową; napełnij ją buforem do transferu tak, aby kaseta była całkowicie zanurzona. Następnie umieść w dolnej części plastikowej kasety transferowej gąbkę lub wkład z włókna szorstkiego.

Następnie należy wziąć arkusz papieru filtrującego dociętego do tego samego rozmiaru co żel. Należy go uprzednio zwilżyć buforem do transferu i położyć na gąbce typu scotch bright. Po zakończeniu 30-minutowej równowagowania żelu, należy umieścić żel na papierze filtrującym.

Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza znajdujące się między żelem a papierem filtrującym, delikatnie przesuwając probówkę lub szklaną rurkę po powierzchni żelu. Można również użyć wałka BioRad, który znajduje się w zestawie BioRad. Pamiętaj o stosowaniu rękawiczek podczas pracy z papierami filtrującymi, żelami i membranami.

Tłuszcz z dłoni zablokuje proces transferu. Następnie przygotuj membranę transferową. Wytnij membranę o rozmiarze odpowiadającym żelowi, dodając jeden do dwóch milimetrów z każdej krawędzi.

Następnie należy powoli umieścić membranę w wodzie destylowanej, wprowadzając jedną krawędź pod kątem 45 stopni; woda będzie podciągana do membrany, aż ostatecznie zwilży całą jej powierzchnię. Jeśli membrana zostanie wprowadzona do wody zbyt szybko, uwięzione pęcherzyki powietrza pojawią się w postaci białych plam. W tych obszarach nie dojdzie do transferu białka.

Po całkowitym zwilżeniu membrany należy ją równoważyć przez 10 do 15 minut w buforze do transferu. Ta procedura zwilżania sprawdza się w przypadku membran nitrocelulozowych i nylonowych. Tylko membrany PVDF są hydrofobowe i nie zostaną zwilżone samym umieszczeniem ich w wodzie destylowanej lub buforze do transferu.

Membrany PVDF należy najpierw zanurzyć w 100% metanolu na jedną do dwóch sekund, a następnie inkubować przez 10 do 15 minut w buforze do transferu. Nie wolno dopuścić do wyschnięcia membrany w żadnym momencie.

Jeśli to nastąpi, ponownie zwilż membranę metanolem, a następnie buforem do przenoszenia. Po przygotowaniu membrany umieść ją bezpośrednio na górnej powierzchni żelu. Pamiętaj, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza znajdujące się między żelem a membraną, delikatnie przesuwając po powierzchni membrany szklaną rurkę lub wałek BioRad.

Następnie nawilż kolejny kawałek papieru filtracyjnego Whatman o grubości 3 mm. Połóż go na błonie i ponownie usuń wszystkie pęcherzyki powietrza. Następnie połóż na tym papierze filtracyjnym kolejną gąbkę szorującą typu Scotch-Brite lub zwykłą gąbkę.

Zakończ montaż „kanapki” do immunoblottu, blokując górną część kasety transferowej. Po złożeniu zestawu do immunoblottu można przystąpić do transferu białek z żelu na membranę. Aby rozpocząć procedurę transferu, napełnij komorę elektroforetyczną buforem do transferu i umieść kasetę transferową zawierającą zestaw w urządzeniu do elektroblottingu.

Ważne jest ułożenie „kanapki” w taki sposób, aby membrana była skierowana w stronę anody lub dodatnio naładowanej strony komory. Podłącz przewody zasilacza do odpowiednich stron anody i katody aparatury do elektrotransferu. Ten konkretny model urządzenia do transferu jest wyposażony w chłodzący blok lodowy.

Następnie przeprowadź transfer elektroforetyczny białek z żelu na membranę przez 30 do 60 minut przy napięciu 50 V z chłodzeniem lub przez noc przy 14 V w pomieszczeniu chłodniczym. Po zakończeniu transferu wyłącz zasilacz i rozmontuj aparat. Następnie wyjmij membranę z aparatu do transferu i zaznacz jej orientację, odcinając narożnik.

Na tym etapie membrany można wysuszyć i przechowywać w szczelnym plastikowym worku w temperaturze 4°C przez rok. Przed dalszą obróbką wysuszone membrany PVDF należy umieścić w niewielkiej ilości 100% metanolu w celu ich nawilżenia. Następnie należy przenieść je do wody destylowanej, aby usunąć metanol.

Po zaznaczeniu orientacji, zabarw żel, aby zweryfikować wydajność transferu. W celu wizualizacji przetransportowanych białek można zabarwić membranę odwracalnie przy użyciu cipro ruby lub nieodwracalnie za pomocą kamasi blue, tuszu indyjskiego, naftolu błękitnego lub złota koloidalnego. Te procedury barwienia nieodwracalnego są niekompatybilne z membranami nylonowymi.

Po przeniesieniu białek na membranę należy przystąpić do immunodetekcji i wizualizacji białek. Na tym etapie unieruchomione na membranie białka są inkubowane ze swoistymi przeciwciałami w celu identyfikacji i ilościowego oznaczenia obecnych antygenów. Aby rozpocząć, należy umieścić membranę w plastikowej kuwecie inkubacyjnej zawierającej 20 milliliters buforu blokującego.

Niektórzy stosują worki, jednak często zamiast nich używa się kuwet, które są szczególnie przydatne podczas przetwarzania dużej liczby pasków w różnych roztworach przeciwciał pierwszorzędowych. Następnie inkubuj zamkniętą membranę przez 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej przy jednoczesnym mieszaniu na wytrząsarce orbitalnej lub platformie kołyszącej. Podczas inkubacji membrany rozcieńcz przeciwciało pierwszorzędowe i bufor blokujący.

Rozcieńczenie określa się empirycznie, zazwyczaj wynosi ono od 1:100 do 1:1000. W przypadku przeciwciał poliklonalnych stosuje się rozcieńczenia od 1:10 do 1:100 dla supernatantów hybrydom, a powyżej 1:1000 dla płynów z myszy zawierających przeciwciała monoklonalne. Po zakończeniu inkubacji należy odlać bufor blokujący.

Wymień bufor na rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe i ponownie inkubuj przez 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej przy stałym mieszaniu. Następnie przemyj membranę cztery razy, wstrząsając z 100 mililitrami TTBS w przypadku filtrów NITROCELLULOSE lub PVDF lub TBS w przypadku filtrów nylonowych.

Każde z myć powinno trwać od 10 do 15 minut; podczas mycia membrany należy rozcieńczyć przeciwciało wtórne w buforze blokującym. Przykłady przeciwciał wtórnych to koniugaty przeciwciał anty-IG z peroksydazą chrzanową lub fosfatazą alkaliczną, dostępne w sprzedaży koniugaty enzymatyczne. Przeciwciała wtórne są zazwyczaj rozcieńczane w zakresie od 1:200 do 1:25 000 przed użyciem.

Po zakończeniu etapów płukania i usunięciu materiałów do płukania, należy dodać rozcieńczony koniugat przeciwciał anty-IG z peroksydazą chrzanową lub fosfatazą alkaliczną i inkubować od 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej przy ciągłym mieszaniu. Po 30 do 60 minutach należy wyjąć membranę z pojemnika i wypłukać ją czterokrotnie, po 10 do 15 minut za każdym razem, w buforze TTBS zgodnie z wcześniejszym opisem.

Po zakończeniu etapów płukania można przystąpić do kroku wizualizacji. Przedtem jednak zaprezentujemy alternatywną procedurę sondowania immunologicznego. Ta alternatywna procedura sondowania immunologicznego opiera się na zestawie Vector Stain ABC firmy Vector Labs.

Metoda ta wykorzystuje kompleks awidyny i biotyny do przyłączenia peroksydazy chrzanowej (HRP) lub fosfatazy alkalicznej (AP) do biotynilowanego przeciwciała wtórnego. Dzisiaj zaprezentujemy zestaw HRP. TTBS dobrze sprawdza się jako bufor blokujący w systemach awidyna-biotyna.

W przypadku filtrów nylonowych zaleca się stosowanie odczynników wiążących białka, ponieważ beztłuszczowe mleko w proszku zawiera resztkową biotynę, która zakłóci analizę immunoenzymatyczną. Należy go użyć wyłącznie w etapie blokowania, aby rozpocząć równoważenie membrany w buforze blokującym w otwartej kuwecie przy ciągłym mieszaniu za pomocą wytrząsarki orbitalnej lub platformy kołyszącej. Inkubuj membranę przez 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej podczas procesu równoważenia.

Przygotuj roztwór przeciwciała pierwszorzędowego. W przypadku membran z nitrocelulozy lub PVDF stosuj TTBS w systemach Aden. Biotin o wysokiej czułości.

Rozcieńczenie sera zawierającego przeciwciało pierwszorzędowe zazwyczaj mieści się w zakresie od 1:1000 do 1:100 000. Zastosowanie chemii chemiluminescencyjnej wymaga wyższego zakresu rozcieńczeń. W naszym przypadku zastosowano metodę chromogenną.

Stosujemy przeciwciało pierwszorzędowe w rozcieńczeniu 1:5 000. Po zakończeniu etapu równoważenia należy usunąć bufor blokujący. Następnie należy dodać taką ilość roztworu przeciwciała pierwszorzędowego, aby całkowicie przykryć membranę.

Inkubować membranę przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy delikatnym kołysaniu. Membranę nitrocelulozową przemyć trzykrotnie w TTBS w odstępach pięciominutowych. Podczas etapu płukania przygotować roztwór biotynilowanego przeciwciała wtórnego, rozcieńczając jedną kroplę biotynilowanego przeciwciała w 10 milliliters TTBS. Po zakończeniu etapów płukania dodać roztwór przeciwciała wtórnego.

Inkubuj membranę przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy powolnym kołysaniu, podczas gdy membrana jest inkubowana z przeciwciałem wtórnym. W tym celu przygotuj avadon biotin HRPO. Wymieszaj dwie krople odczynnika barwiącego vti A i dwie krople odczynnika B w 10 mililitrach.

TTBS dla nitrocelulozy. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej po zakończeniu inkubacji z przeciwciałem wtórnym. Przemyć membranę trzy razy w ciągu 15 minut za pomocą TTBS lub TBS.

Następnie nanieś na membranę roztwór enzymu avidan z biotyną i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy powolnym kołysaniu. Następnie przemyj membranę trzy razy w odstępach 10-minutowych przy użyciu TTBS. Po zakończeniu procedury sondowania immunologicznego białka związane z membraną są gotowe do wizualizacji za pomocą substratów chromogennych.

W tym końcowym etapie wizualizacji, w procedurach immunodetekcji opartych na peroksydazie chrzanowej, powszechnie stosuje się substraty takie jak DAB/ICL oraz TMB. Jeśli ostatnie płukanie membrany podczas procedury sondowania immunologicznego wykonano w TTBS, należy teraz przepłukać membranę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w 50 ml TBS, a następnie umieścić membranę w chromogenicznym roztworze do wizualizacji.

Prążki białkowe powinny pojawić się w ciągu 10 do 30 minut. Po 30-minutowej inkubacji należy usunąć mieszaninę reakcyjną substratu i przerwać reakcję poprzez dodanie wody destylowanej. Immunoblotting jest wieloetapową procedurą stosowaną w tysiącach laboratoriów w celu wykrycia obecności specyficznych białek po elektroforezie 1D lub 2D.

Właśnie zaprezentowałem sposób przeprowadzenia immunoanalizy krwi. To wszystko. Powodzenia w eksperymentach i dziękuję za oglądanie.