Wywiad: Bioreaktory i rusztowania 3D z modyfikowaną powierzchnią w badaniach nad komórkami macierzystymi

Nazywam się Karlan i pracuję jako biofizyk w Instytucie Interfejsów Biologicznych. W Cal Screw Institute of Technology opracowujemy bioreaktory oraz modyfikowane powierzchniowo rusztowania trójwymiarowe do hodowli funkcjonalnych tkanek i badań nad komórkami macierzystymi; interesują nas przede wszystkim oddziaływania komórek z ich sztucznym środowiskiem. W redakcyjnym artykule czasopisma Nature z 2003 roku postawiono pytanie o to, czym jest biologia płaska, a konkretnie, co kryje się pod tym pojęciem?

W przeszłości wiele systemów hodowli in vitro, głównie hodowli monowarstwowych, obarczonych było wadami polegającymi na tym, że np. zróżnicowane komórki pierwotne miały stosunkowo krótki czas życia i ulegały dedyferencjacji podczas hodowli. Oznacza to, że bardzo szybko traciły większość swoich funkcji specyficznych dla danego organu. Dlatego też, w celu odtworzenia lepszych warunków dla tych komórek in vitro, wprowadzono wiele różnych modyfikacji i adaptacji w konwencjonalnych hodowlach monowarstwowych.

Obejmuje to skład pożywki hodowlanej oraz przygotowanie powłok naczyń hodowlanych, w których komórki tworzą głównie monowarstwy. Wszystkie te podejścia wskazują na istotną rolę oddziaływań między komórkami a macierzą, a także na znaczenie komunikacji międzykomórkowej. Kolejnym ważnym aspektem wydaje się być ustanawianie specyficznych dla komórek kontekstów, które są realizowane na przykład przez kompleksy połączeń szczelinowych, stanowiące powszechną cechę wielu komórek in vivo.

W konwencjonalnych hodowlach monowarstwowych komunikacja przez połączenia szczelinowe jest szybko utracona. Przez długi czas możliwe było w pewnym stopniu odtworzenie in vitro tkankowej organizacji komórek przy użyciu tzw. techniki steroidowej.

Przykładem z naszego laboratorium było wykazanie, że nawet dorosłe hepatocyty szczura są w stanie syntetyzować steroidy i pozostają żywotne przez co najmniej kilka tygodni w takich agregatach. Hepatocyty pozostają w bliskim kontakcie ze sobą, co sprzyja komunikacji międzykomórkowej, prowadząc do stabilizacji funkcji specyficznych dla hepatocytów. Stwierdziliśmy jednak również, że ta konwencjonalna technika hodowli trójwymiarowej posiada kilka wad.

Wielkość agregatów jest krytyczna. Duże średnice agregatów mogą indukować nekrozę, a w większości przypadków stosunek objętości pożywki do liczby komórek jest niewłaściwy. Problematyczne mogą być również siły ścinania oraz hodowle w bioreaktorach z mieszadłem (spinner cultures).

Organy i tkanki w żywych organizmach charakteryzują się między innymi bardzo wysoką gęstością komórek; istotną cechą jest również kierowany transport aktywny substancji przez te warstwy tkankowe. W związku z tym realistyczne organotypowe modele tkanek in vitro powinny w jak najdokładniejszy sposób odtwarzać tę naturalną architekturę. Kluczowym czynnikiem ograniczającym takie systemy jest odpowiedni stosunek objętości medium do objętości komórek.

Wspomniałem wcześniej, że zaprojektowaliśmy odpowiednią obudowę dla komórek w formie precyzyjnie mikrostrukturalnego rusztowania polimerowego, które zapewnia pojemniki o jednolitym rozmiarze do trójwymiarowej hodowli agregatów komórkowych. Jako rusztowanie polimerowe stosujemy preferencyjnie PMMA lub PC, polieter lub poliwęglan. Składa się ono z mikrostrukturalnego urządzenia planarnego o powierzchni jednego centymetra kwadratowego, które oferuje gęstą macierz ponad 1000 takich pojemników.

W przypadku trójwymiarowej hodowli agregatów komórkowych wykazano, że system ten jest odpowiedni do hodowli 3D przez kilka tygodni. Każdy z tych małych sześciennych pojemników w matrycy ma krawędź o długości około 300 Micrometers. Specjalna konstrukcja tego rusztowania oraz obrzeży, czyli komory inkubacyjnej.

Układ doprowadzania pożywki i gazów w ektorze umożliwia różne tryby podawania pożywki. Po pierwsze, superfuzję, co oznacza, że obie strony tkanki są osobno zaopatrywane w pożywkę odżywczą, a po drugie, perfuzję.

Oznacza to, że przepływ medium jest wymuszony przez warstwę tkanki. Tryb perfuzji może być wykorzystany do stworzenia warunków lepiej naśladujących unaczynienie in vivo, jednak możliwy jest również tryb mieszany perfuzji i superfuzji. Opracowano różne generacje chipów komórkowych.

Każda generacja może być wykorzystana w określonej konstrukcji, aby sprostać potrzebom dowolnej specjalistycznej aplikacji. Na przykład zbudowano konstrukcje bioreaktorów jedno- i dwuczypniowych, a także oddzielnie adresowalne układy wielotitracyjne lub wysoce zrównoleglone warianty. Jako skalowane wersje ostatniej generacji tych różnych form opracowano tak zwaną technologię mikroformowania termicznego pojemników, która oferuje dodatkową możliwość modyfikacji całej powierzchni tych formowanych trójwymiarowo pojemników; możliwe jest nawet nadanie powierzchni wzoru w skali submikronowej przy użyciu cząsteczek sygnałowych.

Można również włączyć czujniki i elektrody sygnałowe. Zastosowania obejmują zakres od podstawowych badań i biologii komórki po toksykologię i farmakologię, a także możliwość prowadzenia screeningu wysokoprzepustowego. Bardzo istotnym punktem na koniec jest fakt, że ostatnia generacja naszych mikrochipów termoformowanych została zoptymalizowana w celu umożliwienia taniej produkcji masowej, a tym samym zastosowania w innych laboratoriach.