Wywiad: Wycinanie prowiralnego DNA HIV-1 przy użyciu ewoluowanej rekombinazy

Nazywam się JohE Hvar i kieruję Katedrą Biologii Komórki i Biologii w Instytucie HE PET w Hamburgu w Niemczech. Instytut HE PET jest instytutem badań podstawowych, który koncentruje się wyłącznie na ludzkim pe, wirusach patogennych oraz, jak bym to ujął, kwestiach z nimi związanych. Nasz wydział interesuje się przede wszystkim badaniem regulacji ekspresji genów HIV oraz interakcjami, a w szczególności interakcjami wewnątrzkomórkowymi HIV z komponentami komórki gospodarza.

Na podstawie tych danych staramy się również opracować nowe terapie eksperymentalne dla choroby wywołanej przez HIV. Problemem w przypadku HIV jest to, że HIV jest retrowirusem lub lentiwirusem i jak każdy retrowirus, po zakażeniu komórki gospodarza, HIV integruje genom wirusowy z genomem komórki gospodarza. Do tej pory nie opracowano metody pozwalającej na usunięcie zintegrowanego prowirusa.

Oznacza to, że w kontekście terapeutycznym mówimy o chorobie przewlekłej wymagającej dożywotniego leczenia, a co za tym idzie, o wszystkich problemach z tym związanych, takich jak skutki uboczne leków, pojawianie się oporności i tak dalej. Od wielu lat w badaniach podstawowych znamy tzw. rekombinazy, występujące naturalnie w procesach rekombinacji, na przykład u drożdży lub bakterii. Rekombinazy te rozpoznają specyficzne sekwencje DNA, przetasowują geny oraz reorganizują genom i tak dalej.

W badaniach podstawowych, w tym badaniach in situ, szczególnie często wykorzystuje się rekombinazę zwaną Cre. Rekombinaza CRE rozpoznaje swoją specyficzną sekwencję i jeśli dana sekwencja znajduje się pomiędzy dwoma miejscami rozpoznania, CRE jest w stanie wyciąć tę sekwencję pośredniczącą.

Koncepcja ta, istniejąca od 10 lub 15 lat, polega na tym, aby w medycynie wyeliminować wirusa, wykorzystując z drugiej strony rekombinazy, takie jak Cre, do wycięcia prowirusowego DNA. Teoretycznie powinno to być możliwe, ponieważ podczas infekcji HIV odwrotna transkrypcja zamienia jego genom RNA w DNA, a w wyniku tego procesu powstają sekwencje zwane długimi powtórzeniami końcowymi (LTR), które wyznaczają koniec 5' lub początek oraz koniec 3' zintegrowanego prowirusowego DNA. Zatem w teorii, gdyby udało się opracować rekombinazę, która specyficznie rozpoznaje sekwencję w LTR, Cre atakowałaby koniec 5' i koniec 3' zintegrowanego prowirusowego DNA, wycinając go i w ten sposób eliminując wirusa z zainfekowanej komórki. Problem z HIV polega na tym, że występują różne izolaty, być może nawet u jednej osoby, u jednego pacjenta; jednak, z tego co wiemy do tej pory, sekwencja ta znajduje się na początku i na końcu genomu wirusa.

Innymi słowami, sekwencje LTR są bardziej konserwatywne niż na przykład geny HIV. Sądzę zatem, że istnieje duża szansa, iż wystarczy niewielka liczba rekombinantów, które w zasadzie rozpoznają ogromną różnorodność wszystkich izolatów HIV. A jeśli nie, będziemy musieli wygenerować nowy za pomocą ewolucji molekularnej, co w przyszłości może zostać częściowo zautomatyzowane.

I tak będzie – proces ten przebiegnie znacznie szybciej niż w warunkach laboratoryjnych. Do współpracy zaprosiliśmy naszego kolegę, dr. Franka z Instytutu Maxa Plancka, którego widzimy w kadrze. Jest on specjalistą w dziedzinie rekombinaz i pokrewnych zagadnień.

W zasadzie zastosował on metodę, którą nazywamy metodą ewolucji molekularnej. Metoda ta opiera się jednak na technologii PCR, czyli reakcji łańcuchowej polimerazy. Wykorzystał on gen naturalnie występującej rekombinazy Cre i przeprowadził reakcję PCR lub wiele reakcji PCR w warunkach, które wprowadzają mutacje w sposób losowy.

Kluczem jest teraz wyselekcjonowanie nowych wersji rekombinazy, które nabyły nową zdolność lub nową aktywność, a mianowicie rozpoznawania sekwencji specyficznych dla HIV. Proces ten jest przeprowadzany w cyklach powtarzalnych. Wykonał on około 120 lub ponad 120 cykli, stosując tę metodę ewolucji molekularnej.

Kiedy ostatecznie opracowano tę konkretną metodę, obecnie nazywaną rekombinacją specyficzną dla trzech LTR, z nową rekombinazą, która obecnie specyficznie rozpoznaje sekwencje HIV. Wstępne badania, a konkretnie eksperymenty z rekombinazami, zostały przeprowadzone tutaj, w Instytucie HE PET w Hamburgu. To, co zrobiliśmy, polegało przede wszystkim na dostarczeniu tej rekombinazy za pomocą wektorów genowych do ludzkich hodowli komórkowych, które zostały zainfekowane izolatem klinicznym HIV-1.

Z czasem, w ciągu od sześciu do ośmiu tygodni, udało nam się to udowodnić. Obecnie rekombinant jest obiecujący ilościowo; zintegrowano profil HIV DA, co w zasadzie doprowadziło do wyleczenia całej kultury poprzez usunięcie HIV. Technologia ta wiąże się jednak z licznymi problemami.

Przede wszystkim musimy upewnić się, że ekspresja rekombinazy nie powoduje toksycznych efektów ubocznych. Nie spodziewamy się tego, ponieważ w przypadku rekombinacji występujących naturalnie, takich jak gre, istnieją tak zwane zwierzęta transgeniczne. Wykazują one ekspresję tej rekombinacji GRE i co prawda pojawiają się pewne problemy, ale nie są one zbyt znaczące.

Mogę to stwierdzić na tym etapie. Istnieje zatem nadzieja, że nie wystąpią toksyczne skutki uboczne, ale nigdy nie wiadomo, dopóki nie przeprowadzi się eksperymentów. Pojawiają się również problemy związane z tym, że być może nie uda nam się rozpoznać każdego izolatu klinicznego, co uniemożliwiłoby całkowite wyeliminowanie dominującego izolatu HIV u pacjenta.

Będziemy jednak z czasem selekcjonować rzadkie, marginalne izolaty. Nie wiemy jeszcze dokładnie jak, musimy przeprowadzić te eksperymenty. Istnieje natomiast poważny problem z dostarczaniem genów, związany z technologią wektorową.

Musimy zastosować tak zwane wektory lentiwirusowe lub wektory retrowirusowe, aby dostarczyć gen lub gen rekombinazy. Czy występują zatem skutki uboczne? Czy wektory te wywołują efekty toksyczne?

To wszystkie nasze pytania. Mamy również nadzieję na zwiększenie aktywności grzebieni. Rekombinacja przebiega szybciej, niż obserwujemy to obecnie w ciągu ostatnich kilku tygodni w zakresie aktywności.

W związku z tym są to pytania otwarte, na które musimy odpowiedzieć w nadchodzących latach. Obecnie jest to bez wątpienia problem, ponieważ rekombinazy nie są dostępne w formie doustnej. Nie będzie zatem istniała tabletka z rekombinazą, którą można by po prostu przyjąć, aby pozbyć się wirusa.

Rozważając zatem przyszłe metody terapeutyczne, musimy wziąć pod uwagę podejścia oparte na terapii genowej. Można zatem przyjąć koncepcję, w której izoluje się tzw. hematopoetyczne komórki macierzyste lub komórki CD34-dodatnie z krwi pacjentów zainfekowanych HIV. Następnie w warunkach laboratoryjnych wprowadza się gen dla receptorów CCR5 do tych komórek pacjenta.

Na koniec ponownie podajemy, reinfundujemy pacjentowi jego genetycznie zmodyfikowane komórki, wstrzykując je w okolicę lędźwiową tego samego pacjenta. W efekcie układ odpornościowy lub układ krwiotwórczy pacjenta powinien z czasem ulec przynajmniej częściowej rekonstrukcji za pomocą komórek, które po zakażeniu HIV będą w stanie pozbyć się wirusa, ponieważ wykazują one teraz ekspresję rekombinazy. Wynikiem tego będzie spadek wiremii u pacjenta, co z pewnością poprawi jego jakość życia.

Możemy również mieć nadzieję, że układ odpornościowy u tych pacjentów ulega przynajmniej częściowej regeneracji. W związku z tym w pełni funkcjonalne komórki odpornościowe będą – miejmy nadzieję – w stanie zaatakować pozostałe zainfekowane komórki w organizmach tych pacjentów. Tego, czy jesteśmy w stanie całkowicie wyeliminować HIV z organizmu pacjenta, nie możemy obecnie określić.