Przesiewowe badanie agregacji amyloidu metodą półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym z detergentem
16 lipca 2008
SDD-AGE jest użyteczną techniką wykrywania i charakteryzacji polimerów amyloidopodobnych w komórkach. Przedstawiamy tutaj adaptację, która sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań na szeroką skalę.
Witajcie, jestem Randall Hoffman, doktorant w laboratorium Susan Linus na wydziale biologii w MIT. Dzisiaj przedstawię Państwu metodę półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym z dodatkiem detergentu, czyli SDD-AGE. Nasze laboratorium wykorzystuje tę technikę do wykrywania prionów i innych białek amyloidogennych.
Nasza wersja wieku SDD jest prosta i niezawodna, a ponadto może być skalowana w celu dostosowania do dowolnej liczby próbek. Amyloidy są wyjątkowo odporne na denaturację przez SDS, co pozwala na ich oddzielenie od innych białek przy użyciu SDDH. Jednak same dane z SDDH nie mogą służyć do potwierdzenia, że dana substancja jest amyloidem.
Aby to osiągnąć, należy zastosować inne techniki. Mając to na uwadze, pozwolę sobie je zaprezentować. Metodę S-D-D-H-S-D-D-H można przeprowadzić przy użyciu standardowego sprzętu do poziomej elektroforezy DNA.
W pierwszej kolejności należy złożyć formę do odlewania żelu. Wielkość aparatury zależy od liczby próbek. W przypadku dużej liczby próbek stosujemy płytkę o wymiarach 20 na 24 cm oraz do czterech grzebieni 50-dołkowych.
Do przygotowania żelu będą potrzebne niskie EEO agros o średniej lub wysokiej wytrzymałości żelu, bufor 1x TAE oraz 10% roztwór zapasowy SDS. Przygotuj 1,5% roztwór AROS w buforze 1x TAE. Żel powinien być jak najgrubszy, aby umożliwić naniesienie maksymalnej ilości próbki i zmaksymalizować detekcję. Podgrzewaj mieszaninę w kuchence mikrofalowej do całkowitego rozpuszczenia aros.
Szybko dodaj stok XSDS 100X do 0,1% i zamieszaj ruchem wirowym. Jeśli w tym kroku część agaru zestali się, rozpuść go na płycie grzewczej. Należy uważać, aby nie doprowadzić do wrzenia.
Po dodaniu SDS roztwór będzie miał tendencję do pienienia się, dlatego należy go wlać do formy do odlewania, gdy jest jeszcze gorący. Następnie należy użyć grzebienia, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogłyby zakłócić późniejszy transfer żelu. Po całkowitym schłodzeniu i zestaleniu żelu należy ostrożnie wyjąć grzebienie i umieścić żel w komorze.
Całkowicie zanurz żel w buforze one XTAE z 0,1% SDS. Można teraz przystąpić do nakładania próbek. Próbki białek wykorzystywane w SDDH przygotowuje się w taki sam sposób jak w przypadku SDS-PAGE, z dwoma istotnymi wyjątkami.
Po pierwsze, należy unikać podgrzewania próbek, co mogłoby doprowadzić do denaturacji agregatów do monomerów białkowych. Po drugie, należy zadbać o to, aby uniknąć degradacji białek. Ponieważ zastosowane tutaj warunki denaturujące nie są wystarczające do inaktywacji wszystkich proteaz, zalecamy stosowanie co najmniej dwukrotnie większego niż zalecane stężenia kompletnego koktajlu inhibitorów proteaz.
W niniejszej demonstracji wykorzystamy lizaty z komórek drożdży nadekspresujących konkretne białko docelowe. Zazwyczaj stosujemy kultury nocne o objętości 2 ml, hodowane w blokach 96-dołkowych dostępnych w VWR, jednak w przypadku analizy białek o niskiej zawartości należy zastosować większe objętości kultur.
Zebrać komórki poprzez wirowanie hodowli z prędkością 2000 RCF przez pięć minut w temperaturze pokojowej; po wirowaniu usunąć nadsącz i wyprać komórki, resuspendując je w wodzie i ponownie wirować. Po drugim wirowaniu usunąć nadsącz i resuspendować komórki w odpowiednim roztworze do wysiewu. Enzymy w roztworze trawią ściany komórkowe, co pozwoli na efektywną lizę komórek w niewielkiej objętości buforu do lizy. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 30 °C.
Tym razem wirować zapasowe komórki plastikowe w celu otrzymania osadu przy 800 RCF przez pięć minut. Całkowicie usunąć nadsącz, a następnie resuspender każdy osad w 100 µL buforu do lizy. Następnie zakryć blok taśmą i mieszać w wstrząsarze typu vortex z wysoką prędkością przez dwie minuty.
Pozwala to na odwirowanie zanieczyszczeń komórkowych z plastikowych probówek przy 4 000 RCF przez dwie minuty. Ostrożnie przenieś nadsącz do 96-dołkowej płytki PCR.
Zazwyczaj w naszym laboratorium analizujemy setki próbek jednocześnie, dlatego w tym celu wykorzystujemy system do pipetowania cieczy. W razie potrzeby należy oznaczyć stężenie białka w lizatach. Następnie do próbek należy dodać 4x bufor do próbek, aby uzyskać lizaty zawierające 1x bufor do próbek, i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Następnie należy nanieść próbki na żel. Jeśli jest to wymagane, połowę próbek należy zachować do analizy SDS-PAGE. Należy również nanieść markery masy cząsteczkowej, w tym markery wstępnie barwione oraz marker o bardzo wysokiej masie cząsteczkowej, taki jak ekstrakt z fletora kurczaka.
W razie potrzeby ważne jest utrzymywanie żelu w niskiej temperaturze, aby zapobiec dyfuzji białek o niskiej masie cząsteczkowej, dlatego zaleca się przeprowadzanie elektroforezy w pomieszczeniu chłodniczym. Prowadź elektroforezę przy niskim napięciu, poniżej 3 V na centymetr długości żelu. Kontynuuj proces przez kilka godzin, aż front barwnika dotrze do około 1 cm od końca żelu.
Ponieważ amyloid nie ulega denaturacji w 2% SDS w temperaturze pokojowej, pozostanie on nienaruszony, podczas gdy inne kompleksy, w tym większość agregatów nieamyloidowych, rozpadną się w obecności 2% SDS. W związku z tym większość białek będzie występować w formie monomerów i szybko przejdzie przez żel, podczas gdy oporne na SDS amyloidy o wysokiej masie cząsteczkowej będą migrować wolniej.
Po tym kroku żel będzie gotowy do transferu. Chociaż można zastosować wiele metod transferu, najlepsze wyniki uzyskujemy, stosując transfer kapilarny. Ponieważ transfer kapilarny pozwala na pracę z żelem o dowolnym rozmiarze, jest on praktycznym rozwiązaniem przy analizie setek próbek.
Stos suchych papierów do transferu służy do przepychania buforu przez żel, co powoduje osadzanie białek na membranie nitrocelulozowej umieszczonej pomiędzy papierami a żelem. Należy wyciąć kawałek nitrocelulozy, np. high bond C, extra, o wymiarach zgodnych z wymiarami żelu. Należy również wyciąć 20 arkuszy papieru do transferu GB 04 oraz 8 arkuszy papieru do transferu GB 02 o rozmiarze odpowiadającym rozmiarowi żelu.
GB 04 jest bardzo gruby i chłonny. Z kolei GB 02 jest znacznie cieńszy i ma drobniejszą teksturę, co zapewnia bardziej równomierny kontakt z membraną. Wytnij dodatkowy kawałek GB 04, który posłuży jako knot; powinien być on o około 20 centymetrów szerszy niż zanurzony żel.
Przygotowując wodny WIC i cztery kawałki GBO O2 oraz jeden XTBS w plastikowym pojemniku, ułożyć stos papierów w następujący sposób: 20 kawałków suchego GBO O4, następnie cztery kawałki suchego GBO O2, a na końcu jeden kawałek uprzednio namoczonego GBO O2.
Połóż membranę nitrocelulozową na wierzchu tego stosu. Krótko opłucz żel na tacy do odlewania wodą, aby usunąć nadmiar buforu do elektroforezy. Następnie ostrożnie zacznij zsuwać żel z tacy na stos, w razie potrzeby zwilżając membranę TBS podczas zsuwania żelu z tacy.
Nadmiar buforu pomaga zapobiec uwięzieniu pęcherzyków powietrza w żelu. Pipeta transferowa sprawdza się w tym celu po całkowitym przeniesieniu żelu do zestawu do elektroforezy. Należy dokładnie sprawdzić, czy nie pojawiły się pęcherzyki powietrza.
Podnieś krawędź żelu i ponownie nałóż bufor, aż do momentu usunięcia pęcherzyków powietrza. Połóż pozostałe trzy wstępnie zwilżone kawałki GBO na wierzchu żelu. Aby zapewnić dokładny kontakt między wszystkimi warstwami, przesuń mocno pipetę wzdłuż górnej powierzchni stosu.
Po obu stronach stosu do transferu ustaw dwie podwyższone kuwety zawierające TBS, a następnie przerzuć przez stos uprzednio namoczony knot w taki sposób, aby jego oba końce były zanurzone w roztworze. Przykryj tak przygotowany stos do transferu dodatkową plastikową kuwetą z TBS, obciążając ją np. butelką wody o pojemności 500 ml. Knot będzie pobierał bufor z kuwet, a suche papiery do transferu będą przeciągać bufor przez żel w ciągu kilku godzin.
Dzięki temu białka zostaną osadzone na membranie; należy pozwolić transferowi przebiegać przez minimum trzy godziny lub przez noc. Po zakończeniu transferu kapilarnego membranę można poddać standardowej analizie western blotting. Tutaj przedstawiono typowy obraz białek, które wykazano w nadmiernej ekspresji w szczepie drożdży predysponującym określone białka do tworzenia amyloidów.
Wyraźnie widać, że niektóre z naszych kandydatów bardzo dobrze tworzą amyloidy lub wysokocząsteczkowe formy oporne na SDS, jak te pokazane tutaj i tutaj. Inne natomiast nie tworzą agregatów i są całkowicie monomeryczne, jak te i te. Dodatkowo można zauważyć, że wielkość polimerów amyloidu różni się w zależności od białka, co widać w tych dwóch ścieżkach.
Przedstawiliśmy prostą metodę analizy wysokocząsteczkowych, nierozpuszczalnych agregatów, takich jak amyloidy potencjalnych prionów. Mamy nadzieję, że prezentacja była interesująca, a opisana technika okaże się przydatna w badaniach nad białkami immunogennymi amyloidów. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w dalszych badaniach.
Przegląd
SDD-AGE to skuteczna metoda wykrywania i charakteryzowania polimerów amyloidopodobnych w komórkach. Niniejszy artykuł przedstawia adaptację tej techniki do zastosowań na szeroką skalę.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Analiza białek
Wstęp
- Amyloidy są odporne na denaturację przez SDS, co umożliwia ich oddzielenie od innych białek.
- Metodę SDD-AGE można wykorzystać do wykrywania prionów i innych białek alogennych.
- Do przeprowadzenia SDD-AGE można wykorzystać standardowy sprzęt do horyzontalnej elektroforezy DNA.
- Dane z samej metody SDD-AGE nie mogą potwierdzić obecności amyloidu; konieczne jest zastosowanie dodatkowych technik.
Cel badania
- W celu zademonstrowania skalowalnej adaptacji metody SDD-AGE dla dużych liczebności próbek.
- W celu dostarczenia niezawodnej metody przesiewowej do wykrywania polimerów amyloidopodobnych.
- W celu przedstawienia przygotowania i wykonania techniki SDD-AGE.
Zastosowane metody
- Przygotowanie żelu agarozowego o określonych stężeniach i buforach.
- Przygotowanie próbek bez ogrzewania w celu uniknięcia denaturacji.
- Metoda transferu kapilarnego do przenoszenia białek na membrany.
- Stosowanie inhibitorów proteaz w celu zapobiegania degradacji białek podczas procesu.
Główne wyniki
- Skuteczne oddzielenie polimerów amyloidopodobnych od innych białek.
- Wykazana niezawodność techniki SDD-AGE w zastosowaniach na dużą skalę.
- Podkreślenie znaczenia starannego przygotowania i obchodzenia się z próbkami.
- Przedstawienie szczegółowego protokołu efektywnego przeprowadzania SDD-AGE.
Wnioski
- SDD-AGE jest cennym narzędziem dla badaczy analizujących polimery amyloidopodobne.
- Technikę tę można dostosować do analiz wysokoprzepustowych.
- Dalsza walidacja z zastosowaniem dodatkowych technik jest niezbędna do potwierdzenia obecności amyloidu.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Metoda SDD-AGE umożliwia skalowalną detekcję konformerów amyloidu odpornych na SDS, wspierając wczesną walidację celów w przypadku chorób neurodegeneracyjnych i zaburzeń związanych z błędnym zwijaniem białek. Technika ta zapewnia ilościową rozdzielczość agregatów patogennych w oparciu o ich wielkość, co dostarcza informacji niezbędnych do identyfikacji związków wiodących oraz redukcji ryzyka mechanistycznego w procesach odkrywania leków. Jej adaptacja do wysokoprzepustowych przesiewów usprawnia selekcję projektów poprzez odróżnianie kandydatów podatnych na agregację od kontroli monomerowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez rozdzielanie nierozpuszczalnych w SDS konformerów białek z etykietą, co pozwala wyjaśnić potencjał amyloidogenny.
- Wartość operacyjna: Umożliwia ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez bezpośrednią wizualizację gatunków podatnych na agregację w lizatach komórkowych.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność wyboru celu poprzez odróżnianie agregatów patogennych od kompleksów nieamyloidowych na podstawie odporności na detergenty.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość analizy: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych etapów pracy poprzez izolację polimerów odpornych na SDS z rozpuszczonych białek.
- Powtarzalność: Standaryzacja detekcji amyloidu za pomocą transferu kapilarnego, umożliwiająca zastosowanie dowolnego rozmiaru żelu w celu zapewnienia spójnego przetwarzania próbek na dużą skalę.
- Skalowalność przesiewania: Ułatwienie wysokoprzepustowej analizy setek próbek przy użyciu grzebieni wielodołkowych i systemów do manipulacji cieczami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy dane o agregacji z fazy odkrywania z walidacją przedkliniczną poprzez profilowanie polimerów amyloidu z rozdzielczością według rozmiaru.
- Mitygacja ryzyka mechanistycznego: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju leku w oparciu o analizę ryzyka poprzez identyfikację wariantów konformacyjnych o różnym stopniu patogenności.
- Korelacja z biomarkerami: Wspiera opracowywanie translacyjnych biomarkerów poprzez korelację rozmiaru agregatów z fenotypami istotnymi dla przebiegu choroby.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda SDD-AGE wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, umożliwiając analizę mechanistyczną przed etapem badań przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez wykrywanie gatunków wysokocząsteczkowych opornych na SDS, co wskazuje na tworzenie się amyloidu.
- Przesiewy: Zapewnia gotowość do analizy oraz wyniki ilościowe dzięki rozdzieleniu konformerów podatnych na agregację na podstawie ich wielkości.
- Analityka: Dostarcza mierzalne odczyty (wielkość polimeru, odporność na SDS), które umożliwiają analizę porównawczą w różnych warunkach i w zależności od tła genetycznego.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez ustalanie profili agregacji istotnych dla danej choroby w celu priorytetyzacji celów terapeutycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma przesiewowa dzięki skalowalnym formatom żeli i ustandaryzowanym protokołom transferu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: pewność prognostyczna w walidacji celu, zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w testach agregacji.
- Wartość operacyjna: standaryzacja, powtarzalność i skalowalność przy przetwarzaniu setek próbek równolegle.
- Wartość strategiczna: lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach rozwoju terapeutyków białkowych.
- Wpływ na portfolio: priorytetyzacja skorygowana o ryzyko w oparciu o tendencję do agregacji i stabilność konformacyjną.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymagana jest wiedza z zakresu biochemii białek oraz elektroforezy w żelach agarozowych, aby uniknąć denaturacji agregatów.
- Konieczne jest posiadanie sprzętu do poziomej elektroforezy DNA, agarozy, SDS, inhibitorów proteaz oraz materiałów do transferu kapilarnego.
- Wymagana jest standaryzacja postępowania z próbkami w ramach zespołu (brak ogrzewania, inhibicja proteaz) w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Należy uwzględnić kwestie adaptacyjne dla różnych białek z tagami oraz systemów ekspresyjnych (drożdże, komórki ssacze).
- Metoda ogranicza się do wykrywania frakcji nierozpuszczalnych w SDS; nie pozwala na potwierdzenie struktury amyloidowej bez walidacji ortogonalnej (np. ThT, barwienie włókien).
