Reagregacja kultur grasicy

Witajcie, nazywam się Andrea White i reprezentuję laboratorium Grahama Andersona i Erica Jenkinsona w MRC Center for Immune Regulation na Uniwersytecie w Birmingham. Dzisiaj przedstawiam protokół otrzymywania re-agregowanych kultur organowych grasicy, które mogą być wykorzystane do badania złożonych interakcji komórkowych zachodzących podczas różnicowania limfocytów T. Przed rozpoczęciem tej procedury płaty grasicy embrionalnej zostały wyizolowane i poddane obróbce w celu usunięcia wszystkich limfocytów.

Można to zobaczyć na osobnym filmie. Następnie płaty alienoidowe są rozgregowane w celu przygotowania zawiesiny komórek zrębu. Na koniec komórki są agregowane, aby utworzyć re-agregowaną kulturę organową fmic.

Zacznijmy. Po pięciu do siedmiu dniach hodowli organoidy wątroby (LO) powinny być gotowe do dysagregacji w celu przygotowania zawiesiny komórek. Zanurz filtry 0,8 µm w szalce Petri zawierającej pożywkę RPMI 1640 z dodatkiem 10% FCS. Za pomocą pęsety delikatnie oddziel wszelkie fragmenty włókien, które nie odrywają się samoistnie. Użyj pipety 1 ml, aby przenieść organoidy do probówki typu eppendorf 1,5 ml.

Zaleca się umieszczenie maksymalnie 50 płatów w jednej probówce typu endotend. Należy pozwolić płatom opaść na dno probówki pod wpływem grawitacji, a następnie usunąć medium. Płaty należy przemyć 1 mL PBS, po czym ponownie pozwolić im opaść na dno.

Powtórz tę procedurę łącznie trzy razy dla płukania w PBS, usuń ostatnią porcję PBS i dodaj 600 µL roztworu tripsyny 0,25%. Umieść probówkę Eppendorf w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 25 minut. Ostrożnie trituruj płaty, używając niebieskiej końcówki 1 mL w pipecie automatycznej przez 10 sekund, a następnie ponownie umieść je w inkubatorze; po 20 minutach pipetuj płaty w górę i w dół, aby całkowicie je rozagregować.

Proces ten powinien zająć około 30 sekund. Aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek, należy dodać 400 µL lodowatego pożywki RPMI 1640 z dodatkiem 10% FCS w celu neutralizacji trypsyny. Komórki należy odwirować przy 1000 RPM przez 10 minut w temperaturze 4 °C, usunąć nadsącz i w razie potrzeby resuspendować osad w 1 ml RPMI 1640 z dodatkiem 10% FCS. Następnie należy policzyć komórki.

Zazwyczaj spodziewamy się około 50 000 komórek na jeden płat doksazynowy, zaczynając od zarodka w stadium E 15. Teraz jesteśmy gotowi do utworzenia agregatu kultur fmic Corgan w probówce typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Wymieszaj świeżo przygotowane komórki stromalne.

Wraz z wcześniej wyselekcjonowanymi fibrocytami CD4+ CD8+. Zalecamy stosunek komórek zrębowych do fibrocytów w proporcji około 1:1. Liczba wykorzystanych komórek będzie zależeć od dostępnej ich liczby oraz planowanych eksperymentów.

Zalecamy użycie łącznie co najmniej stu tysięcy komórek, ale nie więcej niż 1,5 miliona komórek. Agregaty V powinny być wystarczająco duże, aby zapewnić powtarzalność wyników, ale nie tak duże, aby komórki w ich centrum obumarły. Wirować osad komórkowy z prędkością 1000 RPM przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie ostrożnie złożyć filtr do hodowli organowej.

Usunąć cały nadsącz z etapu za pomocą pipety P 200. W vortexować osad komórkowy przez 10 s, aby utworzyć zawiesinę. Objętość powinna wynosić około 1-2 µL.

Naciągnij zawiesinę do wąskiej pipety, utrzymując zawiesinę komórek w jej końcówce. Pod mikroskopem stereowym ostrożnie nanieś zawiesinę komórek na środek filtra o porach 0,8 µm. Optymalnie komórki powinny zostać naniesione w formie stojącej kropli o średnicy od jednego do dwóch milimetrów.

Jeśli zawiesina zacznie się rozprzestrzeniać, należy odczekać, aż płyn z zawiesiny odpłynie przez porowe membrany przed osadzeniem pozostałych komórek. Umieść szalkę w plastikowym pojemniku i szczelnie zamknij. Podobnie jak w przypadku kultur organowych grasicy, umieść pojemnik w inkubatorze; kultury agregacyjne formują nienaruszone struktury w ciągu 18 godzin hodowli.

Po czterech do pięciu dniach hodowli powstaną dojrzałe subpopulacje cytokin CD4+CD8- oraz CD4-CD8+. Wykorzystanie 50 lobuli traktowanych doksaziną powinno dostarczyć wystarczającą liczbę komórek zrębu do przygotowania od trzech do pięciu kultur reaggregacyjnych. Kultury te zazwyczaj przyjmują formę spójnych skupisk komórek, które można zdjąć z filtrów za pomocą pęsety bez ich rozrywania.

Właśnie opisaliśmy metodę badania selekcji pozytywnej przez komórki nabłonkowe F. Metoda ta może być również wykorzystana do badania selekcji negatywnej pośredniczonej przez komórki dendrytyczne. Ostatecznie, poprzez zastosowanie transgenicznych FIBROCYTÓW TCR lub komórek zrębowych z niedoborem MHC klasy I lub niedoborem MHC klasy II.

System ten umożliwia oddzielne badania selekcji limfocytów T CD4+ lub CD8+. Dziękujemy za oglądanie.