Izolacja jąder neuronalnych z tkanki mózgowej ludzi pobranej po śmierci

Aby zbadać oddziaływania chromatyny z DNA, które regulują specyficzną dla neuronów ekspresję genów w ludzkim mózgu, w pierwszej kolejności należy uzyskać czystą populację jąder neuronalnych. Tkankę ludzkiego mózgu pobraną po śmierci poddaje się homogenizacji, a wszystkie jądra izoluje się za pomocą wirowania w gradiencie gęstości. Następnie jądra są znakowane swoistymi dla neuronów przeciwciałami i izolowane poprzez sortowanie przepływowe, a na koniec zagęszczane metodą ultrawirowania.

Witajcie, nazywam się Anish Matan i pracuję w laboratorium dr Sharon McBarian w departamencie psychiatrii University of Massachusetts Medical School. Dzisiaj zaprezentuję procedurę izolacji jąder neuronalnych z pośmiertnej tkanki mózgu człowieka. Zatem zacznijmy.

Dla każdej próbki jąder przeznaczonej do sortowania należy rozpocząć od tysiąca miligramów zamrożonej tkanki mózgowej pobranej po śmierci. Z tej ilości można uzyskać około 5 milionów jąder neuronalnych po sortowaniu aktywowanym fluorescencją. Aby rozpocząć ekstrakcję jąder, należy umieścić 250 miligramów tkanki mózgowej w probówce typu dounce zawierającej pięć ml buforu lizującego i umieścić ją w lodzie.

Po rozmrożeniu tkanki poddać ją homogenizacji przez jedną minutę w warunkach chłodzenia na lodzie. Po homogenizacji przenieść homogenizat tkankowy do przezroczystej probówki do ultrawirówki o pojemności 15 ml, a następnie umieścić probówkę na lodzie. Powtórzyć proces homogenizacji dla pozostałej części tkanki.

Następnie ostrożnie pipetuj 9 ml roztworu sacharozy na dno probówek do ultrawirowania, aby stworzyć gradient stężeń w taki sposób, by roztwór homogenizowanego tkanki znajdował się nad roztworem sacharozy. Teraz zważ probówki do ultrawirowania, aby zapewnić ich wyważenie podczas ultrawirowania. Wprowadź ewentualne korekty wagi, dodając bufor lizujący do górnej warstwy. Po zważeniu probówek umieść je w ultrawirowarce, używając rotora SW 28, i wirować próbki przy 107163,6 RCF przez 2,5 godziny w temperaturze 4 °C.

Po zakończeniu wirowania odessaj supernatant oraz warstwę resztek znajdującą się na gradiencie stężeń. Należy uważać, aby nie zaburzyć osadu na dnie probówki, który zawiera jądra komórkowe. Następnie dodaj 500 µL 1x PBS do każdego osadu i pozostaw go na lodzie na 20 minut.

Po 20 minutach resuspenduj osady, pipetując zawiesinę w górę i w dół. Inkubacja w lodzie pozwala na częściowe samoistne rozpuszczenie osadów, co ułatwia resuspensję jąder, zmniejszając tym samym stres, jakiego one ulegają. Następnie przenieś resuspensję i jądra do probówek wirówkowych o pojemności 2 ml.

Połącz roztwór kwasów nukleinowych z dwóch probówek do ultrawirówki w każdej z probówek do mikrocentryfugi i ponownie umieść próbki w lodzie. Po zakończeniu ekstrakcji kwasów nukleinowych przejdę do etapu immunobarwienia w celu wyizolowania jąder neuronalnych za pomocą sortowania. Próbkę zawierającą jądra inkubuje się z mieszaniną do immunobarwienia, składającą się z przeciwciała pierwszorzędowego i drugorzędowego oraz roztworów blokujących. Aby przygotować mieszaninę do immunobarwienia, dodaj 1,2 µL przeciwciała specyficznego dla neuronów NeuN do 300 µL 1x PBS. Następnie dodaj 100 µL mieszaniny blokującej, która zawiera 0,5% BSA i 10% normalnego surowicy koziej w 1x PBS.

Na koniec dodaj jeden µL przeciwciała wtórnego o nazwie LOR 4 88. Przygotuj również barwienie immunologiczne dla próbki kontrolnej ujemnej dla tej mieszaniny do barwienia. Pomiń przeciwciało pierwotne i zastąp je 1,2 µL 1x PBS.

Następnie wymieszaj mieszaniny do immunobarwienia w wstrząsarzu wirowym i inkubuj je przez pięć minut w temperaturze pokojowej w ciemności, podczas gdy trwają inkubacje mieszanin barwiących. Przygotuj próbki jąder do kontroli negatywnej: pipetuj 20 µL zawiesiny jąder do probówki o pojemności 2 ml zawierającej 980 µL 1x PBS. Przygotuj również kontrolę niebarwioną, zawierającą wyłącznie roztwór jąder i PBS.

Przenieś 20 µL jąder do drugiej probówki i uzupełnij objętość do 1 mL za pomocą 1x PBS. Następnie umieść wszystkie próbki z powrotem na lodzie. Do tego czasu mieszaniny do barwienia immunocytochemicznego powinny być już gotowe.

W fazie inkubacji dodaj 401 µL mieszaniny do odpowiedniej próbki. Do próbki z jądrami komórkowymi dodano mieszaninę zawierającą zarówno przeciwciało pierwotne, jak i LOR 4 88. Do próbki kontrolnej negatywnej dodano mieszaninę zawierającą wyłącznie przeciwciało wtórne LOR 4 88, natomiast do próbki kontrolnej niebarwionej nie dodano żadnego barwnika immunocytochemicznego.

Następnie przenieś próbki do rotatora i inkubuj je w ciemności przez 45 minut. Po zakończeniu 45-minutowej inkubacji przeniosę próbki do centrum cytometrii przepływowej na University of Massachusetts Medical School w celu przeprowadzenia sortowania aktywowanego fluorescencją. Podczas transportu do centrum próbki należy przechowywać w lodzie i w ciemności. W centrum cytometrii przepływowej próbki są najpierw filtrowane przez filtr 40 µm, a następnie analizowane w urządzeniu przez kilka minut, przy jednoczesnym zachowaniu niskiej temperatury.

Jest to wykonywane w celu uzyskania wstępnych danych przed sortowaniem. Kontrola niebarwiona określa stopień fluorescencji negatywnej. Na podstawie tych informacji należy dostosować czułość urządzenia na fluorescencję.

Barwiona kontrola służy do kontroli autofluorescencji. Wszelki szum tła wynikający z autofluorescencji w tym punkcie pozwala na ustawienie odpowiednich bram niezbędnych do sortowania. Do sortowania próbek wykorzystuje się kilka różnych bram.

Oto typowe dane dla pierwszej bramki. Ten wykres analizy FACS przedstawia reprezentatywną próbkę po dostrojeniu bramki. Pierwsza bramka rozpoznaje wzorce debris i żywotnych jąder na podstawie kombinacji ustawień, takich jak fluorescencja i ogólne doświadczenie wizualne.

Oś X reprezentuje rozproszenie przednie, które odpowiada względnej wielkości, natomiast oś Y odpowiada za rozproszenie boczne, które odzwierciedla złożoność wewnętrzną, taką jak ziarnistość. Pierwsze bramkowanie pozwala również określić wielkość poszczególnych jąder obecnych w próbce. Umożliwia to oddzielenie zanieczyszczeń od właściwych jąder; poniżej przedstawiono typowe dane z drugiego bramkowania.

Ten wykres FACS przedstawia przykład drugiej bramki, która umożliwia sortowanie poszczególnych jąder przy jednoczesnym odrzuceniu agregatów. Bramka ta analizuje różnice w czasie przejścia jąder przez wiązkę lasera. Obiekty będące agregatami zazwyczaj potrzebują więcej czasu na przejście.

Ten konkretny parametr jest bardzo istotny, ponieważ obecność agregatów może zakłócać ocenę czystości, gdyż niektóre fluorescencyjne jądra mogą być związane z jądrami niewykazującymi fluorescencji. Na koniec przedstawiamy typowe dane z trzeciego bramowania. Brama ta jest ustawiona na konkretną długość fali fluorescencji odpowiadającą fluorochromowi obecnemu w naszym przeciwciele wtórnym.

Na tym wykresie FACS na osi x widoczny jest poziom fluorescencji, a na osi y detektor kanału głębokiej czerwieni PECy7. Takie wykresy kropkowe zapewniają lepszą wizualizację w porównaniu do pojedynczego histogramu kolorystycznego. Zastosowanie bramkowania (gatingu) pozwala na posortowanie i oddzielenie pozytywnych jąder neuronalnych od negatywnych jąder nieneuronalnych.

Po wybraniu wszystkich bram jądra są sortowane do jednego XPBS. Gdy cała próbka przejdzie przez sortowanie, sprawdź czystość procesu, przepuszczając przez instrument Eloqua posortowanej próbki. Oto przykład optymalnego wyniku.

W tym miejscu porównano próbkę przed sortowaniem, zawierającą zmieszaną populację jąder, z posortowaną populacją Eloqua, w której wyeliminowano większość jąder negatywnych. Należy zauważyć, że wartości procentowe czystości opierają się na liczbie zdarzeń zanieczyszczających próbkę, wyznaczonych na podstawie ustawionych bramek. Należy pamiętać, że podczas pierwszego przejścia próbki przez urządzenie może dojść do częściowego wybielenia, co spowoduje osłabienie sygnału; aby to uwzględnić, konieczne może być wprowadzenie pewnych korekt.

Po posortowaniu próbki należy rozpocząć procesowanie jąder. W tym celu należy pobrać 10 µL posortowanej próbki i dodać 2 µL roztworu sacharozy, 50 µL 1 M chlorku wapnia oraz 30 µL 1 M octanu magnezu. Jeśli objętość posortowanej próbki jest mniejsza niż 10 µL, należy uzupełnić ją do 10 µL za pomocą 1X PBS lub odpowiednio dostosować ilość dodawanych odczynników.

Następnie kilka razy odwróć probówkę z próbką i pozostaw ją w lodzie na 15 minut. Po 15 minutach odwiruj próbkę w rotorze z koszykami przy 1 786 RCF przez 15 minut w temperaturze czterech stopni. Po wirowaniu ostrożnie odessij nadsącz, nie naruszając białego osadu znajdującego się na dnie probówki.

Następnie rozpuścić osad w 200 µL odpowiedniego roztworu wymaganego do poprzednich eksperymentów. W tym przypadku rozpuszczamy osad w buforze do rozcieńczania w celu przeprowadzenia kolejnego eksperymentu na chipie. Następnie resuspenderć osad, pipetując go w górę i w dół.

Na tym etapie można przenieść jądra do mniejszej probówki i umieścić ją w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu dalszego wykorzystania. W ten sposób zaprezentowałem proces izolacji jąder neuronalnych z ludzkiej tkanki mózgowej pobranej po śmierci. Z tak przygotowanych jąder można przeprowadzić szereg różnych analiz, takich jak immunoprecypitacja chromatyny.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby próbki zawsze przechowywać w lodzie, ponieważ jądra komórkowe nie są utrwalone i mogą ulec degradacji w wysokiej temperaturze. Ważne jest również, aby tkanki ludzkie przetwarzać zgodnie ze standardami bezpieczeństwa poziomu biosafety level two lub wyższego. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.