Selektywne znakowanie białek powierzchni komórkowych z użyciem minimalnych barwników fluorescencyjnych CyDye DIGE Fluor

Nazywam się Maria i pracuję w Y Healthcare w NOS w Szwecji. Białka powierzchni komórkowych często uczestniczą w komunikacji między komórkami a ich otoczeniem, dlatego stanowią one szczególne zainteresowanie badaczy dążących do lepszego zrozumienia chorób, jak i innych wariancji biologicznych wywołanych zmianami w środowisku komórkowym. W tym filmie zaprezentuję prosty protokół znakowania białek powierzchni komórkowych metodą „side-eye dodge”, dzięki któremu będziecie mogli wizualnie wzbogacić te białka o niskiej liczebności bez konieczności wzmacniania fizycznego oraz badać różnice między tymi białkami powierzchni komórkowych przy użyciu tej technologii.

Jeśli ta technologia wydaje się interesująca, więcej informacji można znaleźć w podręczniku 2D. Ponadto przygotowaliśmy notatkę aplikacyjną dotyczącą tego konkretnego zagadnienia, którą można pobrać z job. W przedstawionym powyżej protokole znakowania powierzchni komórek znakowanie odbywa się, gdy komórki są jeszcze nienaruszone. Podczas procesu znakowania barwnik będzie miał dostęp wyłącznie do białek powierzchniowych komórek.

Po etapie znakowania analizowane są komórki w celu weryfikacji specyficzności znakowania powierzchni komórkowych. Próbka oznakowana została poddana frakcjonowaniu na białka błonowe i cytozolowe. Równolegle przygotowano próbkę niefrakcjonowaną.

Dla porównania, analiza frakcjonowania nie jest konieczna, lecz została tutaj przeprowadzona jedynie po to, aby wykazać, że protokół powierzchni komórkowych jest specyficzny dla białek powierzchniowych. Przeprowadziliśmy również standardowy protokół znakowania ETH bez diety, przedstawiony poniżej; w tej metodzie komórki są lizeowane przed znakowaniem, dzięki czemu wszystkie białka komórkowe są dostępne do znakowania. Po etapie znakowania próbki poddawane są elektroforezie 2D.

Adherentne komórki są odrywane za pomocą procedury nieenzymatycznej, aby uniknąć trawienia białek powierzchniowych komórek, które są celem badania. W niniejszym protokole wykorzystujemy gumowy „policeman” (rubber policeman), jednak opcją jest również zastosowanie medium do dysocjacji komórek Enzyme Three. Należy policzyć i podzielić zawiesiny komórkowe na aliquoty zawierające od 5 do 10 milionów komórek na probówkę. Następnie komórki są wirowane w celu uzyskania osadu i przemywane w H-P-S-S-P-H 7.4, aby usunąć pozostałości pożywki hodowlanej.

Zanieczyszczenia pożywki białkami surowiczymi i komponentami fluorescencyjnymi mogą zakłócać znakowanie i detekcję. Komórki hodowane w zawiesinie są bezpośrednio wirowane i płukane przed etapem znakowania następującym po płukaniu. Osad komórkowy jest resuspendsowany w 200 µl lodowatego buforu do znakowania zawierającego HPSS pH 8.5 oraz jednomolowy mocznik.

W celu zapewnienia optymalnych warunków znakowania białek powierzchniowych komórek należy zawsze sprawdzać pH. Przed znakowaniem zastosowano 600 pmol side-eye na 10 milionów komórek CHO. Optymalny stosunek side-eye do liczby komórek będzie różnić się w zależności od typu komórek.

Ponieważ dokładne stężenia białek na powierzchni komórek nie są znane, sposób wyznaczania optymalnych warunków dla znakowania białek metodą side-eye opisano w podręczniku zasad i metod elektroforezy 2D. Komórki inkubuje się z side eye D floor, minimal dice przez 20 minut na lodzie w ciemności.

Po reakcji znakowania nieprzereagowany barwnik jest gasić poprzez dodanie 20 µL 10 mM lizyny. Znakowane komórki są następnie dwukrotnie płukane w zimnym buforze HPSS pH 7.4, aby usunąć nadmiar barwnika. Dzięki temu w kolejnym kroku, którym jest liza komórek, nie pozostanie wolny barwnik mogący spowodować niepożądane znakowanie wewnątrzkomórkowe lub białek.

Białka na powierzchni komórek są już znakowane, a komórki zostały przemyte i są gotowe do lizy. Osad z ostatniego etapu przemywania resuspenduje się w 150 µL zimnego buforu do lizy zawierającego 7 M mocznika, 2 M tiomocznika, 4% CHAPS, 30 mM Tris, 5 mM octanu magnezu o pH 8,5 i pozostawia na lodzie przez co najmniej jedną godzinę, okazjonalnie mieszając na wirówce vortex. Próbki są teraz gotowe do rozdziału 2D.

Pierwszym krokiem w procesie elektroforezy jest przygotowanie pasków IPD do rehydratacji. Przygotuj odpowiedni roztwór do rehydratacji, dodając bufor IPG odpowiadający zakresowi pH stosowanych pasków, a następnie wlej roztwór do komór tacki do rehydratacji. Usuń folię ochronną z paska IPG i ostrożnie umieść paski wysuszonym żelem do dołu w tacki do rehydratacji zawierającej roztwór do rehydratacji.

Zamknij pokrywę kasety IPG i pozostaw paski do rehydratacji przez noc. W pierwszym wymiarze, czyli w ogniskowaniu izoelektrycznym, białka są rozdzielane zgodnie z ich pI. Proces ten jest przeprowadzany przy użyciu urządzenia IPG four three.

Rehydratowane paski umieszczono w kolektorze i zamontowano na nich elektrodę. Za pomocą nakrywek do aplikacji próbek naniesiono 50 µg z każdej próbki. Zastosowano albo bezpośrednio próbki niefrakcjonowane, bez wcześniejszego frakcjonowania, albo próbki uprzednio rozdzielone na frakcje błonowe i cytozolowe przed ich naniesieniem.

Osłonę zamknięto, aby chronić fluorescencyjne próbki przed światłem. Instrument zaprogramowano zgodnie z zaleceniami i uruchomiono na noc. Duże żele 12% lamby zostały przygotowane przy użyciu żelu 12 dla osobników dorosłych.

Dodano roztwór wypierający Costera, aby zapobiec polimeryzacji żeli akrylamidowych w przewodach. Przed użyciem żele pozostawiono do polimeryzacji przez noc w temperaturze pokojowej. Po ogniskowaniu izoelektrycznym paski są usuwane i poddawane równoważeniu w buforze zawierającym SDS w dwóch etapach: najpierw z użyciem DTT w celu redukcji mostków dwusiarczkowych reszt cysteiny, a następnie poprzez alkilację jodOAc, aby zapobiec modyfikacji przez akrylamid.

Paski IPG zanurza się w buforze do elektroforezy, a następnie ostrożnie układa na powierzchni dużych żeli dwukierunkowych. Aby zapobiec powstaniu pęcherzyków powietrza między paskami a żelem, na górę nanosi się roztopiony 2% roztwór agro z błękitem bromofenolowym. Żele są teraz gotowe do rozdziału w drugiej wymiarowości za pomocą elektroforezy SDS-PAGE.

Białka zostaną rozdzielone zgodnie z masą cząsteczkową przy użyciu systemu tonal six. Należy wypełnić komorę elektroforetyczną anodowym buforem do elektroforezy, włożyć żele i wypełnić górną komorę katodowym buforem do elektroforezy. Zaprogramuj zasilacz zgodnie z zaleceniami i przeprowadź drugą wymiarowość w ciemności przez około cztery do pięciu godzin lub do momentu, aż czoło barwnika dotrze do dolnej krawędzi żelu.

Po elektroforezie w drugim wymiarze kasety żelowe są umieszczane za pomocą chwytaków w fluorescencyjnym skanerze Typhoon. Dwa żele i trzy kanały mogą być skanowane jednocześnie. Wynik tej dwuwymiarowej elektroforezy (2D-PAGE) wykazuje wysoką rozdzielczość białek błonowych w próbce, mimo znanych ograniczeń w wykrywaniu białek hydrofobowych w tej metodzie. Wyniki pokazują wiele nowych plamek znakowania powierzchni komórkowych, przedstawionych tutaj na czerwono, które nie zostały wykryte przy użyciu standardowego protokołu znakowania, przedstawionego tutaj na zielono.

Wyniki te wskazują, że protokół znakowania powierzchni komórki jest wysoce specyficzny dla białek powierzchniowych. Dzięki temu, że znakowane są wyłącznie białki powierzchniowe, są one łatwiejsze do wizualizacji, a uniknięto tłumienia sygnału przez liczne białka cytozolowe. Na górze przedstawiono obraz fluorescencyjny żeli z niefrakcjonowaną frakcją błonową lub frakcją cytozolową.

Poniżej znajduje się obraz tego samego żelu po barwieniu srebrem. Wyniki nie wykazują znakowania fluorescencyjnego białek cytozolowych, natomiast barwienie srebrem potwierdza obecność białek w żelach. Wyniki wykazują również podobne wzory rozmieszczenia plamek dla frakcji niefrakcjonowanej oraz błonowej, co dowodzi, że frakcjonowanie przed elektroforezą 2D nie jest konieczne, co czyni ten protokół prostym i wygodnym.

SI dwa, SI trzy oraz SCI pięć wykazują podobne wzorce znakowania i są zgodne z protokołem badania powierzchni komórek. Przeprowadzono eksperyment dietetyczny z wykorzystaniem wszystkich trzech wariantów side eye DI floor minimal dy w celu zbadania różnicowej ekspresji białek powierzchni komórkowych w komórkach CHO poddanych głodzeniu seryjnemu przez różne okresy czasu. Próbki powierzchni komórkowych CY dwa ze wszystkich próbek w eksperymencie zostały połączone i wykorzystane jako standard wewnętrzny.

W okresie głodzenia można było śledzić różnicowe zmiany kilku białek powierzchniowych komórki. Z zastosowaniem protokołu izolacji białek powierzchniowych wykryto ponad 18 nowych białek błonowych, których nie zidentyfikowano przy użyciu standardowego protokołu identyfikacji białek w żelu preparatywnym. Konieczne było wzbogacenie próbki powierzchniowej (spike), aby ułatwić przypisanie wyników do plamek w zbiorze danych analitycznych.

Oto wyniki. Wyniki wykazują wysoką rozdzielczość dla dużej liczby białek powierzchniowych komórek. Protokół ten jest bardzo specyficzny dla białek powierzchniowych komórek i nie zaobserwowano znakowania białek wewnątrzkomórkowych.

Dzięki tej metodzie można wykryć więcej białek powierzchni komórki w porównaniu do standardowego protokołu, a jak już zauważono, jest to procedura bardzo prosta do przeprowadzenia. Białka powierzchni komórki są po prostu znakowane, gdy są jeszcze nienaruszone, a następnie poddawane bezpośrednio elektroforezie 2D bez frakcjonowania błon. Jest to zatem bardzo dobra metoda do badania białek powierzchni komórki oraz różnic między nimi z wykorzystaniem technologii D.