Metoda barwienia przeciwciałami całych preparatów u kurczaka
2 lutego 2009
W niniejszym filmie zaprezentowano immunohistochemię w preparatach całych (whole mount immunohistochemistry), czyli metodę pozwalającą na wizualizację przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji antygenu w młodych embrionach kurczaka. Metoda ta została pierwotnie wprowadzona przez Jane Dodd i Toma Jessella.
Niniejszy materiał wideo prezentuje poszczególne etapy immunohistochemii całego preparatu (whole mount) w embrionie kurczaka z wykorzystaniem przeciwciał wtórnych sprzężonych z HRP. Najpierw embrion jest utrwalany w paraformaldehydzie, a następnie blokowana jest endogenna aktywność peroksydazy.
Następnie zarodek inkubuje się w przeciwciałach pierwszorzędowych. Po kilku etapach przemywania zarodek inkubuje się w przeciwciałach wtórnych sprzężonych z HRP. Reakcję barwną ujawnia się przy użyciu substratu DAB, a barwienie przeciwciał przybiera kolor pomarańczowy. Przewagą tej metody nad zastosowaniem przeciwciał fluorescencyjnych jest możliwość przygotowania zarodków do cięcia w wosku, co umożliwia badanie lokalizacji antygenów w przekroju poprzecznym.
Witajcie, jestem Delphine z Laboratorium FIN w Centrum Medycyny Środowiskowej i Genomicznej na Texas A&M w Houston. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wykonywania barwień przeciwciałami w preparatach z embrionów kurzych z zastosowaniem przeciwciał sprzężonych z HRP. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania morfologii embrionów po podaniu leków przeciwpadaczkowych.
Zacznijmy zatem. Aby przeprowadzić immunohistochemię całego preparatu na embrionach kurczaka, należy najpierw otworzyć jajo, stukając w skorupkę pęsetą i usuwając jej fragmenty. Usuń gęste białko pęsetą, a następnie odchyl worek żółtkowy za pomocą pęsety anatomicznej tak, aby embrion był skierowany ku górze.
Następnie użyj precyzyjnych nożyczek, aby wyciąć kwadrat z worka żółtkowego wokół embrionu. Wyjmij embrion z żółtka za pomocą łyżeczki i umieść go w naczyniu z PBS pod mikroskopem stereoskopowym. Ostrożnie usuń błony z żółtka i przenieś embrion do nowego naczynia zawierającego PBS.
Po przeniesieniu zarodka, unieruchom go za pomocą pęsety i szpilek entomologicznych, a następnie odessaj PBS. Zastąp go 4% PFA w PBS i pozostaw zarodek do utrwalenia na jedną godzinę w temperaturze pokojowej, aby zminimalizować potencjalną kontaminację mikrobiologiczną. W każdym z poniższych kroków po utrwaleniu zarodka stosuj zdejonizowaną wodę H2O; odessaj roztwór utrwalający i zutylizuj go zgodnie z procedurami dla odpadów chemicznych.
Napełnij szalkę roztworem BS.Następnie, używając nożyka do mikrodysekcji, wytnij kwadrat wokół embrionu, aby usunąć dodatkowe błony pozazarodkowe. Po wyjęciu szpilek owadniczych usuń je za pomocą pincety. Użyj pipety Pasteura z zaokrąglonym końcem, aby przenieść embrion do fiolki scyntylacyjnej zawierającej PBT.
Przemyć embrion w PBT trzykrotnie po 10 minut każdorazowo. Usunąć PBT z fiolki scyntylacyjnej i zastąpić ją PBTX zawierającym 0,3% H₂O₂ w celu inaktywacji potencjalnej endogennej peroksydazy. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej na rotatorze.
Przemyj embrion w PBT najpierw trzy razy po 10 minut, a następnie trzy razy po 30 minut. Aby przeprowadzić barwienie embrionu przeciwciałem, rozpocznij od płukania embrionu przez jedną godzinę w buforze blokującym lub 1%BSA 1%NGS.
Stosujemy NGS, ponieważ przeciwciało wtórne zostało otrzymane u kozy. Inkubujemy na mutatorze przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej; po inkubacji rozcieńczamy przeciwciało pierwotne w stosunku jeden do jednego w buforze blokującym i inkubujemy zarodek w tym roztworze przez dwa dni w temperaturze 4 °C. Na mutatorze.
Współczynnik rozcieńczenia przeciwciała pierwszorzędowego zależy od wybranego przeciwciała. W tym przypadku używamy przeciwciała z banku hybrydom DOMA opracowanego na potrzeby badań rozwojowych, dostarczonego w formie supernatantu. Rozcieńczamy go w stosunku jeden do jednego w buforze blokującym.
Następnie przeprowadź trzy 10-minutowe płukania w PBT, a następnie trzy jednogodzinne płukania w PBT. Po płukaniu rozcieńcz przeciwciało wtórne w stosunku 1:2 500 w buforze blokującym. W tym przypadku jest to koniugowana z peroksydazą przeciwciała kozie anty-US IgG; inkubuj zarodek w tym roztworze przez noc w temperaturze 4 °C na rotatorze.
Przeprowadzić trzy 10-minutowe płukania w buforze PBT, a następnie trzy jedno godzinne płukania w PBT, aby rozwinąć reakcję barwną w barwionym embrionie. Pierwsze dwa 20-minutowe płukania wykonać w buforze Tris (100 mM Tris, HCl pH 7.4). Następnie usunąć z probówki z embrionem ostatnią porcję buforu TS i zastąpić ją 5 ml roztworu DAB.
Przechowywać w ciemności w inkubatorze przez 20 minut. Pozbyć się końcówki do pipety do pojemnika z 10% roztworem wybielacza. W celu dekontaminacji DAB dodać 16 µl.
Dodaj H₂O₂ do probówki zawierającej embriony w DAB. Przechowuj w ciemności. Po 10 minutach monitoruj reakcję pod mikroskopem, aż reakcja barwna zostanie zakończona. Zutylizuj DAB w wiadrze z wybielaczem i zastąp go pięcioma mililitrami.
Woda z kranu. Następnie przeprowadź dwa 10-minutowe przemycia w PBS w celu przygotowania do fotografii i sekcjonowania w wosku. Odwodnij zabarwiony embrion w serii etanolu 25%, 50%, 75% i 100% przez 10 minut w każdym roztworze.
Po odwodnieniu zastąp etanol od 0,5 do 1 ml olejku cedrowego. Sprawi to, że zarodek stanie się przezroczysty, co umożliwi fotografowanie w olejku cedrowym. Po zakończeniu fotografowania umieść zarodek z powrotem w fiolce i zastąp olejek cedrowy 100% ethanolem.
Na koniec należy zastąpić etanol 5% fast green FCF w 100% etanolu i inkubować przez trzy minuty. Krok ten sprawi, że zarodki będą widoczne podczas badania histologicznego. Następnie roztwór fast green FCF należy zastąpić 100% etanolu i przygotować próbki do badania histologicznego.
Oto trzy przykłady barwionych embrionów. Te embriony w stadium 11 są znakowane przeciwciałem 15.3 B dziewięć lub nie. Jedno z nich to specyficzne przeciwciało przeciwko sznurkowi węzłowemu opracowane w laboratorium Jane dod i Toma Gessela.
Po dwóch minutach w DAB zarodek pozostaje przezroczysty. Po 20 minutach w DAB w obrębie sznura węzłowego pojawia się słabe znakowanie. Ostatecznie, po 40 minutach, znakowanie sznura węzłowego jest pełne.
W tym przykładzie pokazujemy, jak przeciwciało PAC seven, opracowane w laboratorium Toma Jessela, rozpoznaje wczesne etapy zamykania rurki neuralnej, a także komórki grzebienia neuralnego w obrębie czaszki wyłaniające się z mózgu przedniego. Tutaj embrion został oznakowany sondą Croc 20 z laboratorium Davida Wilkinsona, a następnie jednym przeciwciałem. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób przeprowadzania immunohistochemii w preparatach całych embrionów.
Niniejszą procedurę można zastosować również do embrionów, które zostały wcześniej poddane hybrydyzacji in situ w całym preparacie. W takim przypadku należy krótko utrwalić embrion przez jedną godzinę po hybrydyzacji in situ, a następnie przystąpić do barwienia przeciwciałami. To wszystko.
Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy film demonstruje immunohistochemię całych preparatów, technikę stosowaną do wizualizacji przestrzennych i czasowych wzorców ekspresji antygenów w młodych embrionach kurcząt. Metoda ta obejmuje kilka etapów, w tym fiksację oraz inkubację z przeciwciałami, w celu uzyskania wyników barwienia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwoju
- Immunohistochemia
Wstęp
- Immunohistochemia całego preparatu umożliwia badanie rozmieszczenia antygenów w embrionach.
- Technika ta została pierwotnie wprowadzona przez Jane Dodd i Toma Jessella.
- Dostarcza ona wiedzy na temat procesów rozwojowych i ekspresji genów.
- Przeciwciała wtórne sprzężone z HRP poprawiają wizualizację antygenów.
Cel badania
- Zaprezentowanie procedury immunohistochemii całych preparatów.
- Wizualizacja ekspresji antygenu w embrionach kurczaka.
- Porównanie zalet tej metody w stosunku do technik z użyciem przeciwciał fluorescencyjnych.
Zastosowane metody
- Fiksacja embrionów w paraformaldehydzie.
- Blokowanie endogennej aktywności peroksydazy.
- Inkubacja z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi.
- Reakcja barwna ujawniona przy użyciu substratu DAB w celu wizualizacji.
Główne wyniki
- Barwienie przeciwciałami ma kolor pomarańczowy, co wskazuje na pomyślną detekcję antygenu.
- Zabarwione zarodki mogą zostać poddane dalszej obróbce w celu wykonania przekrojów w wosku.
- Metoda ta umożliwia przeprowadzenie badań przekrojowych miejsc lokalizacji antygenów.
- Wykazuje skuteczność przeciwciał koniugowanych z HRP w procesie barwienia.
Wnioski
- Immunohistochemia całych preparatów jest cenną techniką badania embrionów kurzych.
- Umożliwia ona wyraźną wizualizację wzorców ekspresji antygenów.
- Metoda ta jest korzystna dla późniejszej analizy histologicznej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Immunohistochemia całych preparatów w embrionach kurczęt umożliwia przestrzenne mapowanie ekspresji antygenów, co wspiera walidację celów w neurobiologii rozwojowej. Metoda ta pozwala na ograniczenie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie celów molekularnych z efektami fenotypowymi w systemie istotnym dla danej jednostki chorobowej. Kompatybilność z sekcjonowaniem w wosku pozwala zespołom interdyscyplinarnym korelować dane immunohistochemiczne z analizą histologiczną, co poprawia ciągłość translacyjną w przedklinicznej ocenie celów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację rozkładu antygenów w rozwijającej się rurce neuralnej i somytach.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki bezpośredniej obserwacji oddziaływania z celem w nienaruszonych embrionach.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność wyboru celu poprzez dostarczenie danych o ekspresji z rozdzielczością przestrzenną w celu identyfikacji wiodących kandydatów.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość testu: Generuje zestandaryzowane, powtarzalne wzory barwienia z wykorzystaniem przeciwciał wtórnych sprzężonych z HRP i substratu DAB.
- Wynik ilościowy: Umożliwia półilościową ocenę miejsc antygenowych poprzez intensywność koloru, co wspiera optymalizację testu.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Kompatybilne z sekcjonowaniem w wosku, co pozwala na wykorzystanie tej samej zabarwionej próbki w wielu kolejnych procesach analitycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla badań nad chorobami: Możliwość zastosowania w badaniu efektów embriotoksycznych związków, takich jak leki przeciwpadaczkowe, w modelu kręgowców.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etapy odkrywania i badań przedklinicznych poprzez umożliwienie spójnego śledzenia antygenów w preparatach całych oraz w sekcjach.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Pozwala ustalić, czy obserwowane fenotypy korelują z modulacją celu w rozwijających się tkankach.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od fazy odkrywania do badań przedklinicznych, wspierając wczesne etapy walidacji punktów uchwytu oraz opracowywania testów przed optymalizacją związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez poprzez ujawnianie czasoprzestrzennej ekspresji antygenów w rozwijającym się mózgu i rurce neuralnej.
- Screening: Dostarcza zestandaryzowanych odczytów immunohistochemicznych, które wspierają powtarzalną ocenę związków w układach embrionalnych.
- Analityka: Generuje sygnał chromogenny wykrywalny za pomocą mikroskopii w polu jasnym, co umożliwia ilościową analizę obrazu w celu porównania warunków.
- Badania translacyjne: Wspiera dopasowanie biomarkerów, umożliwiając walidację lokalizacji antygenu zarówno w preparatach całych obiektów, jak i w przekrojach histologicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi wielokrotnie wykorzystywalną platformę histologiczną, którą można zastosować w wielu projektach badających toksyczność rozwojową lub ekspresję celu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez powiązanie obecności antygenu z konkretnymi strukturami embrionalnymi.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji etapów utrwalania, blokowania i inkubacji z przeciwciałami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań poprzez dostarczenie histologicznego potwierdzenia modulacji celu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o profile oddziaływania z celem rozwojowym.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie sekcji zarodków, immunohistochemii oraz detekcji chromogennej.
- Zależne od dostępu do mikroskopów, mikrotomów oraz systemów wentylacyjnych do pracy z DAB i H2O2.
- Niezbędna jest standaryzacja rozcieńczeń przeciwciał oraz protokołów płukania w obrębie zespołów badawczych.
- Adaptacja do innych gatunków może wymagać optymalizacji etapów przepuszczalności i blokowania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują dłuższy czas inkubacji oraz konieczność ostrożnej utylizacji DAB w celu zapobiegania powstawaniu artefaktów.
