Technika seryjnego pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego z cysterny wielkiej u myszy

Procedurę rozpoczyna się od znieczulenia myszy i przygotowania pola operacyjnego. Następnie mysz umieszcza się w pozycji brzusznej w aparacie stereotaktycznym. Wykonuje się cięcie strzałkowe skóry poniżej potylicy, a tkankę podskórną i mięśnie szyi rozdziela się tępo wzdłuż linii środkowej.

Następnie tylną część ciała opuszcza się tak, aby ciało tworzyło kąt 135 stopni z unieruchomioną głową, a następnie szklaną kapilarą przebija się oponę twardą w okolicy cisterna magna w celu pobrania płynu mózgowo-rdzeniowego. Po pobraniu płynu mózgowo-rdzeniowego mięśnie są odpowiednio ułożone, a skórę zaszywa się; podskórnie wstrzykuje się około jednego mililitra 0,9% NaCl soli fizjologicznej, aby zapobiec odwodnieniu, i utrzymuje się mysz w cieple do czasu wybudzenia. Cześć, nazywam się Liu i pracuję w laboratorium dr Karen Duff w The Top Institute na Columbia University.

Dzisiaj pokażę Państwu, jak pobierać płyn mózgowo-rdzeniowy z opuszki twardej u myszy. Dzięki tej technice możemy pobierać seryjne próbki CSF do trzech razy od tej samej myszy w odstępach dwu- lub trzymiesięcznych. W naszym laboratorium stosujemy tę metodę do oznaczenia poziomów beta-amyloidu lub białka tau w CSF w różnym wieku u naszych transgenicznych modeli mysich choroby Alzheimera, a następnie korelujemy te wartości z wynikami uzyskanymi z tkanki mózgowej.

Na koniec interesuje nas potencjał poziomów beta lub tau w CSFA jako potencjalnych markerów biologicznych progresji choroby, a także do badań terapeutycznych u myszy. Zatem zacznijmy. Do tej procedury konieczne jest wykonanie kapilar za pomocą polaryzatora mikropipety.

Użyte w tej procedurze kapilary to szklane kapilary krzemianowe BOA B 175 10 firmy Sutter Instruments; wyciąga się je na mikro-pipetniku płomieniowym Sutter P 87 przy indeksie ciepła ustawionym na 300 i indeksie ciśnienia ustawionym na trzy 30. Kapilara szklana ma długość 5 cm i zwężającą się końcówkę. Końcówkę kapilary przycina się nożyczkami tak, aby jej średnica wewnętrzna wynosiła około 0,5 mm.

Procedura chirurgiczna rozpoczyna się od znieczulenia myszy ketaminą w dawce 100 mg/kg oraz ksylazyną w dawce 10 mg/kg podanymi dootrzewnowo; podczas znieczulenia należy utrzymywać mysz w cieple w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Po upewnieniu się, że zwierzę jest w pełni znieczulone poprzez sprawdzenie odruchu cofania łapy po uciśnięciu palca, należy zgolić sierść na szyi, a następnie umieścić mysz w aparacie stereotaktycznym, takim jak model firmy David Kink. W bezpośrednim kontakcie z matą grzewczą należy umieścić rektalną sondę temperatury, aby móc regulować ciepło z maty w zależności od temperatury ciała myszy.

Zabezpiecz głowę za pomocą adapterów, przemyj skórę szyi 10%povidone iodine oraz 70%ethanol trzy razy, a następnie wykonaj nacięcie strzałkowe poniżej tylnej części głowy lub potylicy. Kolejne kroki należy przeprowadzić pod mikroskopem sekcyjnym, używając pęsety tępym końcem. Oddziel tkankę podskórną i mięśnie M by ventor services oraz M rectus capita dorsalis major w taki sposób, aby odsłonić oponę twardą sternum magna. Użyj odpowiednio pary mikroretraktorów, aby rozsunąć mięśnie.

Na koniec połóż mysz tak, aby głowa była ustawiona pod kątem 135 stopni względem ciała. Mysz jest teraz gotowa do pobrania płynu mózgowo-rdzeniowego. Ta technika pobierania CSF z cisterny magna została opisana w poprzednich publikacjach.

Rysunek 1 A pod mikroskopem stereoskopowym. Opona twarda przejawia się jako lśniący i przejrzysty odwrócony trójkąt, przez który widoczne są rdzeń przedłużony i główne naczynie krwionośne. Arteria dural spinella, rysunek 1 B. Widoczne są pulsacje krążenia rdzenia oraz sąsiadującej przestrzeni wypełnionej CSF.

Osiuś twardą oponę mózgową do sucha za pomocą sterylnego patyczka bawełnianego, wprowadź kapilarę do cisterna magna przez twardą oponę mózgową, bocznie w stosunku do arteria dorsalis spinalis. W momencie prawidłowego wprowadzenia kapilary nastąpi zauważalna zmiana oporu, a następnie do kapilary zacznie wpływać płyn mózgowo-rdzeniowy. Po pobraniu płynu mózgowo-rdzeniowego ostrożnie wyjmij kapilarę i połącz ją z strzykawką o pojemności 3 ml za pomocą rurki polietylenowej o średnicy wewnętrznej 1 mm.

Wstrzyknij CSF do probówki o pojemności 0,5 ml. Opisz probówkę i natychmiast zamroź ją na suchym lodzie. Po zamrożeniu przenieś CSF do zamrażarki w temperaturze -80 °C.

Zaprezentowana właśnie technika pobierania próbek jest niezwykle delikatna i pozwala na pobieranie kolejnych próbek CSF od tej samej myszy w odstępach od dwóch do trzech miesięcy. W związku z tym, po pobraniu próbki z szyi, mięśnie i skórę należy odpowiednio ułożyć i zamknąć szwami. Po zaszyciu nacięcia należy wstrzyknąć podskórnie około onego mililitra 0.9%NACL roztworu soli fizjologicznej, aby nawodnić mysz.

Utrzymuj mysz w cieple, w temperaturze około 37 °C, aż do momentu wybudzenia. Monitoruj jej masę ciała w pierwszym oraz siódmym dniu po operacji. Właśnie zaprezentowałem sposób pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego z cysterny wielkiej myszy.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o trzech ważnych kwestiach. Po pierwsze, należy odpowiednio ustawić głowę i ciało myszy w aparacie stereotaktycznym, aby obszar Cy Magna był jak najbardziej odsłonięty. Po drugie, podczas przebijania durometru kapilarą należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych.

W przeciwnym razie próbka zostanie zanieczyszczona krwią. Na koniec należy pamiętać o zapewnieniu myszom ciepła przez cały czas trwania procedury, aby zapobiec hipotermii. Hipotermia jest nie tylko szkodliwa dla zwierząt, ale może również znacząco wpłynąć na wyniki poprzez indukowanie produkcji beta lub relacji tall hypo phosphorylation.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.