Processamento eficiente de células auxiliares foliculares T tonsilares e análise funcional por meio de citometria de fluxo de alta dimensão

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para coleta e processamento de amostras de amígdalas, fenotipagem usando citometria de fluxo espectral de alta dimensão e realização de análises não supervisionadas.

Resumo

As células T foliculares auxiliares (Tfh) são um subconjunto de células T auxiliares CD4⁺ que auxiliam na troca de isotipo de células B, formação de centro germinativo (GC), hipermutação somática e maturação de afinidade, ajudando assim a orquestrar respostas imunes humorais adaptativas em tecidos linfóides secundários durante infecção, autoimunidade e vacinação. Compreender o desenvolvimento e a função das células Tfh é crucial para projetar vacinas eficazes e desenvolver estratégias de tratamento direcionadas para doenças que envolvem essa população. As células das amígdalas humanas são órgãos linfóides da mucosa acessíveis. Eles oferecem uma oportunidade única de traçar o perfil de populações imunes distintas, como células Tfh e GC, interrogar interações célula a célula, avaliar funções celulares dinâmicas e descobrir seus mecanismos regulatórios no nível do órgão. Além disso, as culturas in vitro de células de amígdalas são fáceis de processar e permitem a avaliação da biologia celular Tfh sob várias condições. Aqui, apresentamos um protocolo para coleta, isolamento, preservação e cultura de células de amígdalas humanas. Também descrevemos dois painéis de citometria de fluxo espectral otimizados projetados para caracterização aprofundada de células Tph. Por último, usando um tratamento com inibidor da proteína fosfatase 2A (PP2A) como exemplo, demonstramos a eficiência e o poder das análises não supervisionadas de dados de citometria de fluxo de alta dimensão, descobrindo efetivamente as diferenças induzidas pelo tratamento em uma escala de alta dimensão.

Introdução

As células T foliculares auxiliares (Tfh) são um subconjunto distinto de células T auxiliares CD4⁺ que são essenciais para a formação e função dos centros germinativos (GCs) e produção de anticorpos de células B. As células Tfh se originam de células T CD4⁺ virgens por meio de interações com células apresentadoras de antígenos e da integração de fatores intrínsecos e extrínsecos, incluindo sinalização de receptores de células T, interações coestimulatórias com células B, citocinas e quimiocinas¹. As células Tfh expressam CXCR5 e PD-1, que orientam sua posição dentro ou perto do GC. BCL-6 é o fator de transcrição mestre crítico para o desenvolvimento, manutenção e função do Tfh ^1,2. As células Tfh são fundamentais para a montagem de respostas imunes humorais, particularmente nas respostas vacinais e na defesa contra patógenos bacterianos e virais. Respostas anormais das células Tfh estão implicadas em vários distúrbios, incluindo doenças autoimunes, imunodeficiência e potencialmente algumas formas de câncer 3,4,5,6. Compreender sua função e regulação é, portanto, importante para o desenvolvimento de estratégias vacinais e terapêuticas eficazes⁷.

Em contraste com outras células T auxiliares CD4 ⁺ como Th1, Treg e Th17, para as quais os sistemas de diferenciação in vitro estão bem estabelecidos⁸, as células Tfh são mais complexas de estudar porque seu desenvolvimento envolve interações dinâmicas célula a célula e estruturas anatômicas especializadas⁷. Assim, os estudos de células Tfh têm se baseado amplamente na fenotipagem ex vivo de células Tfh circulantes periféricas humanas (cTfh) e modelos de camundongos in vivo . Investigar a regulação de moléculas específicas em células Tfh é, portanto, um desafio, particularmente para células Tfh humanas⁹. Assim, um estudo ex vivo aprofundado de células Tfh derivadas de tecidos linfóides é essencial para melhorar nossa compreensão das células Tfh humanas.

As amígdalas, como órgãos linfóides secundários, abrigam populações de células únicas que não estão presentes no sangue periférico, como células pré-Tfh (CXCR5^intPD-1^int CD4⁺) e GC-Tfh (CXCR5^hiPD-1^hi CD4⁺), ambas instrumentais na formação de GCs. Além disso, as amígdalas palatinas são alguns dos tecidos mais comumente removidos em cirurgias pediátricas e são facilmente acessíveis, tornando-as uma fonte inestimável de tecido humano para explorar mecanismos imunológicos complexos envolvendo células Tph. Por estarem situadas nas vias aéreas superiores, local primário de infecções virais respiratórias, as amígdalas oferecem um tecido vantajoso para investigar as respostas imunes a essas infecções virais. Por exemplo, nosso laboratório caracterizou anteriormente células Tfh em amígdalas e adenóides de crianças que convalesceram de COVID-19 e comparou esses tecidos com os de controles não infectados¹⁰. Aqui, descrevemos nosso protocolo para processar e armazenar células de amígdalas. Usando amígdalas tratadas com inibidores de PP2A como exemplo, detalhamos como caracterizar essas células por meio de citometria de fluxo espectral de alta dimensão e analisamos os dados usando análise não supervisionada.

Protocolo

O Código de Ética da Associação Médica Mundial (Declaração de Helsinque) foi seguido em todas as pesquisas humanas deste estudo. Amostras de amígdalas humanas foram obtidas de pacientes com hipertrofia adenotonsilar causando distúrbios respiratórios do sono ou apneia obstrutiva do sono, provenientes da Divisão de Otorrinolaringologia Pediátrica, Children's National Hospital, Washington, DC, EUA. Este estudo recebeu aprovação do Conselho de Revisão Institucional (IRB) do Children's National Hospital (protocolo IRB número 00009806). O consentimento informado foi assinado pelos pais ou responsáveis de todos os participantes inscritos, e o consentimento foi obtido dos participantes menores de idade com 7 anos ou mais.

1. Coleta de amígdalas humanas e isolamento e armazenamento de célula única

1. Isolamento de células únicas tonsilares
   1. Coleta de peças cirúrgicas
      1. Obtenha amígdalas de pacientes submetidos a amigdalectomia e colete os pedaços de tecido fresco na sala de cirurgia em um tubo centrífugo de 50 mL preenchido com 25-35 mL de meio de amígdala estéril gelada: RPMI suplementado com 5% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS), 0,05 mg/mL de gentamicina, 10 mM de glutamina e mistura antibiótica-antimicótica (100 unidades/mL de estreptomicina, 100 unidades/mL de penicilina, e 0,25 μg/mL de anfotericina B).
         NOTA: As amígdalas no meio acima podem ser armazenadas a 4 °C durante a noite e processadas no dia seguinte. Perda mínima de viabilidade celular foi observada com armazenamento noturno versus processamento no mesmo dia (Figura 1A). As amígdalas também podem ser enviadas durante a noite no gelo.
   2. Processamento de amígdalas
      NOTA: Todos os meios, tampões e ferramentas cirúrgicas devem ser estéreis, e o isolamento das células das amígdalas deve ser realizado em gelo em uma capa de biossegurança.
      1. Colocar as amígdalas numa placa de cultura de células de plástico de 60 mm contendo 5 ml de meio de amígdalas refrigerado. Trabalhe no gelo. Usando uma pinça e tesoura estéreis ou um bisturi, remova cuidadosamente quaisquer coágulos sanguíneos, gordura e tecido conjuntivo visíveis (Figura 1B, C).
      2. Mova as amígdalas para uma nova placa de cultura de células de 60 mm com 5 mL de meio de amígdala gelado. Corte os pedaços de amígdala em fragmentos de 3-5 mm.
      3. Preparar uma nova placa de cultura de células de 60 mm com 10 ml de meio de amígdalas frias e colocar um coador de células de 70 μm na placa.
      4. Mova os fragmentos de amígdala para o filtro e esmague os fragmentos de amígdala usando a extremidade do êmbolo de uma seringa estéril de 3 mL através do filtro.
      5. Recolha o meio contendo células fora do filtro no prato e transfira para um tubo cônico de 50 mL.
      6. Adicione mais 10 mL de meio amígdala ao prato com a peneira, esmague os fragmentos de amígdala com o êmbolo e colete o meio no tubo cônico. Para amígdalas grandes, repita esta etapa 2-3x mais até que apenas fragmentos de tecido conjuntivo sejam deixados no filtro. Coloque o tecido restante e as placas usadas em um saco de risco biológico e no lixo médico.
      7. Encha o tubo cônico de 50 mL até o topo com meio amígdala.
      8. Centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C.
         NOTA: Estender a centrifugação para 20 min pode aumentar o rendimento.
      9. Remova o sobrenadante aspirando ou pipetando cuidadosamente e ressuspenda o pellet em 5 mL de tampão de lise de cloreto de amônio-potássio (ACK) à temperatura ambiente (RT) para lisar os glóbulos vermelhos. Incube por 5 min em RT e, em seguida, adicione 35 mL de PBS resfriado para evitar lise adicional. Centrifugue a 400 × g durante 5 min a 4 °C.
      10. Lave uma vez com 50 mL de PBS resfriado e centrifugue. Ressuspenda com 10 mL de PBS e estique as células através de um filtro de plástico de 70 μm. Contar células.
2. Criopreservação de células tonsilares
   1. Prepare o meio de congelamento (90% de FBS inativado por calor e 10% de dimetilsulfóxido (DMSO)).
      NOTA: Isso pode ser armazenado a 4 ° C por até 1 mês.
   2. Centrifugar a suspensão celular (passo 1.1.2.10) a 400 × g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular com meio de congelação.
      NOTA: Aconselhamos congelar as células a uma densidade de 10 × 10⁶ a 50 × 10⁶ células/mL de meio de congelamento¹¹.
   3. Alíquota 0,5-1 mL da suspensão celular em criogeniais estéreis. Congele os frascos para injetáveis em recipientes de congelação com taxa controlada num congelador a -80 °C. Transfira os frascos para um tanque de armazenamento contendo nitrogênio líquido dentro de uma semana para preservação a longo prazo.
3. Descongelamento de células congeladas
   NOTA: Uma abordagem de descongelamento por diluição sequencial referenciada a partir de um protocolo de preparação de amostra para sequenciamento de RNA de célula única é descrita abaixo¹². Outros métodos de descongelamento também podem funcionar, mas encontramos maior viabilidade celular com essa abordagem em comparação com a colocação imediata das células no tampão de descongelamento quente (Figura 1D). O tampão de lavagem pode ser preparado com antecedência. O tampão de descongelamento é composto de tampão de lavagem mais 0,1 mg / mL de DNase I (DNase I deve ser adicionada imediatamente antes de iniciar o descongelamento). Aumentar o tempo de centrifugação para 1 min/mL (para tubos de 15 mL) é opcional para aumentar o rendimento da célula.
   1. Aquecer um banho-maria a 37 °C. Pré-aqueça o tampão de descongelamento e lavagem no banho-maria a 37 °C.
      NOTA: Todas as lavagens de células são realizadas em RT.
   2. Descongele os criotubos no banho-maria a 37 °C por 2-3 min imediatamente após a remoção do armazenamento. Evite submergir totalmente o frasco para injetáveis no banho-maria. Remova o frasco do banho-maria enquanto um pequeno cristal de gelo permanece visível.
   3. Transfira suavemente as células descongeladas para um tubo cônico de 15 mL usando uma ponta de pipeta de orifício largo em uma capa de biossegurança. Enxágue o criogênico com 0,5 mL de tampão de descongelamento pré-aquecido e adicione o enxágue gota a gota (1 gota a cada 5 s) ao tubo cônico de 15 mL, agitando suavemente o tubo para misturar.
   4. Dilua as células sequencialmente no tubo cônico de 15 mL adicionando incrementalmente 2 mL e depois 4 mL de meio com ~ 1 min de tempo de espera entre as adições. Adicione o meio a uma taxa de 1 mL a cada 3-5 s ao tubo, girando suavemente para misturar.
   5. Centrifugar a 400 × g durante 5 min à RT.
   6. Remova o sobrenadante; ressuspender o sedimento celular em 300 μL de tampão de descongelamento; e incubar em RT por 5 min.
   7. Adicione 10 mL de tampão de lavagem (sem DNase I). Centrifugue novamente a 400 × g por 5 min em RT.
   8. Lavar mais uma vez: remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 ml de tampão de lavagem. Centrifugar a 400 × g durante 5 min a RT.
   9. Filtrar as células através de um filtro de 70 μm. Centrifugue novamente por 5 min a 400 × g em RT e conte as células. Ressuspender no meio de cultura.

2. Medição da expressão de citocinas intracelulares e fatores de transcrição após tratamento ex vivo

NOTA: Aqui, detalhamos nosso método para caracterização fenotípica de células Tfh tonsilares usando dois painéis de citometria de fluxo de alta dimensão. Dado que a atividade de PP2A é essencial para a expressão ideal da proteína BCL-6 e diferenciação de Tfh⁴, ilustramos nossa avaliação da manutenção e funcionalidade das células Tfh por meio do exame de células de amígdalas tratadas com o inibidor de PP2A cantaridina (CAN).

1. Coloração por citometria de fluxo
   1. Coloração intracelular de citocinas
      NOTA: As incubações são realizadas no escuro. Reagentes, anticorpos e suas respectivas quantidades por poço utilizados em ambos os painéis estão listados na Tabela de Materiais. Para avaliar a degranulação das células T, o anticorpo anti-CD107a é adicionado durante a etapa de tratamento para minimizar os resultados falso-negativos causados por sua internalização¹³.
      1. A placa 2 × 10 células de⁶ amígdalas com 200 μL de meio de cultura (1 × 10⁷ células/mL) em um poço de placa inferior U de 96 poços com as seguintes quantidades de inibidor de PP2A CAN por 16 h: controle do veículo, 3 μM e 6 μM.
         NOTA: O CAN foi reconstituído a 0,1 M com 1% de DMSO.
      2. Adicione monensina (0,7 μL / mL), brefeldina (1: 1.000), acetato de miristato de forbol (50 ng / mL, PMA), ionomicina (1.000 ng / mL) e 2 μL anti-CD107a a cada poço por 2,5 h em incubadora de CO 5%₂ a 37 ^oC. O volume total de cultura é de 200 μL por poço.
      3. Centrifugue anticorpos de coloração a ~ 16.000 × g por 3-5 min a 4 ° C para remover agregados de anticorpos. Prepare a mistura de anticorpos de superfície para a etapa 2.1.1.8, que inclui todos os anticorpos de superfície, exceto os receptores de quimiocina, Brilliant Stain Buffer Plus e FACS buffer (volume de cada um anotado na Tabela de Materiais, total de 112 μL de mistura por reação).
      4. Depois de completar 2,5 h em cultura, lave as células 2x com 200 μL de PBS gelado, centrifugando a 400 × g por 2 min a 4 ° C. Entre as lavagens, descarte o sobrenadante invertendo rapidamente a placa. Realize a coloração na mesma placa.
      5. Incube as células em 100 μL / poço de corante azul VIVO / MORTO diluído 1: 800 em PBS por 15 min em RT. Lave 2x com 200 μL de tampão FACS.
      6. Ressuspenda as células com True Stain Monocyte Blocker (5 μL de bloqueador de monócitos + 45 μL de tampão FACS por poço) por 5 min em RT.
      7. Adicione sequencialmente anticorpos do receptor de quimiocina diretamente à reação de coloração (primeiro, anti-CXCR3 e anti-CCR7 por 10 min cada, seguidos por uma mistura de anti-CXCR5 e anti-CCR6 junto com 10 μL de Brilliant Stain Buffer Plus por 5 min em RT). Misture bem após cada adição, pipetando para cima e para baixo várias vezes. Consulte a Tabela de Materiais para volumes de anticorpos.
      8. Adicione a mistura de anticorpos de superfície preparada na etapa 2.1.1.3 diretamente à reação de coloração e incube por 30 min em RT. O volume total de coloração por reação é de 180 μL: 50 μL de bloqueador de monócitos em tampão (ver etapa 2.1.1.6) + 18 μL de anticorpos anti-receptores de quimiocinas (ver etapa 2.1.1.7) + 112 μL de mistura de anticorpos de superfície (ver etapa 2.1.1.3).
      9. Lave 2x com 200 μL de tampão FACS frio.
      10. Ressuspenda as células e incube com 80 μL / poço de tampão de fixação à base de paraformaldeído em RT por 20 min.
      11. Adicione 160 μL de tampão de permeabilização 1x a cada poço, que já contém tampão de fixação. Centrifugue a placa a 400 × g por 2 min em RT e lave 1x com 200 μL de tampão de permeabilização.
      12. Prepare a mistura de anticorpos de citocinas intracelulares (ICS), que inclui anticorpos anticitocinas, Brilliant Stain Buffer Plus e tampão de permeabilização (volume total de 50 μL / poço, Tabela de Materiais). Incube as células com esta mistura de anticorpos de citocinas intracelulares em RT por 30 min.
      13. Lavar 2x com tampão de permeabilização de 200 μL/poço. Ressuspenda com 200 μL/poço de tampão FACS.
      14. Armazene as células coradas a 4 ° C no escuro e adquira dados em um citômetro de fluxo espectral dentro de 24 h para minimizar a perda de intensidade de coloração¹⁴.
   2. Coloração do fator de transcrição nuclear
      1. Cultive as células com CAN como na etapa 2.1.1.1 (sem estimular as células).
      2. Adicione o anticorpo anti-CD40 humano (0,5 μg/mL) ao meio de cultura e cultive com células por 15 minutos antes de iniciar a coloração. Se as células forem estimuladas, adicionar esse anticorpo 15 min antes de iniciar a estimulação para evitar a internalização do CD40L após a ativação ^15,16.
      3. Centrifugue os anticorpos de coloração e prepare a mistura de anticorpos de superfície semelhante à etapa 2.1.1.3: anticorpos de superfície na Tabela de Materiais, 10 μL / poço de Brilliant Stain Buffer Plus e 54,1 μL / poço de tampão FACS.
         NOTA: O volume total de coloração por poço é de 180 μL: 50 μL de bloqueador de monócitos em tampão + 13 μL de anticorpos receptores de quimiocinas + 117 μL de mistura de anticorpos de superfície.
      4. Lave as células e execute a coloração LIVE/DEAD Blue e a coloração e lavagens da superfície como nas etapas 2.1.1.5-2.1.1.8.
         NOTA: O anticorpo anti-CXCR3 não está incluído neste painel.
      5. Fixe as células com 80 μL de tampão de fixação do fator de transcrição nuclear do FoxP3 / Conjunto de tampão de coloração do fator de transcrição. Incubar por 30 min em RT.
      6. Lave as células com tampão de permeabilização como na etapa 2.1.1.11.
      7. Prepare a mistura de anticorpos do fator de transcrição intracelular (TF), que inclui anticorpos antifator de transcrição listados na Tabela de Materiais, 10 μL de Brilliant Stain Buffer Plus e 16 μL de tampão de permeabilização (volume total de 40 μL/poço). Incubar as células com esta mistura durante 1 h a 4 °C.
      8. Lavar e adquirir num citómetro espectral, como indicado nos passos 2.1.1.13-2.1.1.14.

3. Análise não supervisionada de dados de citometria de fluxo de alta dimensão

NOTA: Software, pacotes e suas versões usadas para análise estão listados na Tabela de Materiais. As capturas de tela das etapas 3.2 a 3.4 estão no Arquivo Suplementar 1. Os scripts de exemplo das etapas 3.5 a 3.7 estão noArquivo S upplemental 2 e no Arquivo Suplementar 3, as etapas 3.8 a 3.9 estão no Arquivo Suplementar 4 e no Arquivo Suplementar 5. Os arquivos brutos ICS e TF para os scripts são fornecidos no Arquivo Suplementar 6 e no Arquivo Suplementar 7, respectivamente.

1. Abra a área de trabalho do software de análise de citometria de fluxo onde os arquivos ".fcs" são armazenados e conclua o gating conforme mostrado na Figura 1E.
2. Clique com o botão direito do mouse no nó de destino (células T CD4⁺ neste caso). Escolha Selecionar nós equivalentes.
3. Clique com o botão direito do mouse no nó de destino novamente. Selecione Exportar/Concatenar Populações.
4. Aguarde até que a janela Populações: Exportar ou Concatenar seja aberta, escolha os valores do canal CSV e escolha o destino dos arquivos exportados. Inclua todas as células na caixa Incluir eventos e selecione Todos os parâmetros compensados na caixa Parâmetros . Expanda as Opções Avançadas, digite um prefixo para renomear os arquivos e clique em exportar para exportar os arquivos para a pasta de destino (exporte um arquivo .csv para cada amostra).
5. Leia os arquivos "*.csv" exportados com R (um para cada amostra). Atribua um ID de amostra a cada célula e combine células de todas as amostras em um único quadro de dados.
6. Adicione ou mescle metadados (informações adicionais sobre amostras) no quadro de dados.
7. Reduza aleatoriamente a amostragem de um número igual de células por amostra para a análise a seguir. Esta etapa é opcional.
   NOTA: Neste exemplo, 8.000 células T CD4 ⁺ foram reduzidas do total de células T CD4 ⁺ de cada condição, representando pelo menos 1/7 do número total de células T CD4 ⁺ .
8. Criar objeto Seurat: interprete os valores do canal para marcadores de anticorpos como níveis de expressão gênica ao criar um objeto Seurat.
   1. Crie o objeto Seurat com o quadro de dados gerado a partir da etapa 3.6. Ignore a etapa NormalizeData e salve-os diretamente como ensaio de "dados".
   2. Selecione os marcadores de superfície no painel de fluxo para usar como VariableFeatures no agrupamento não supervisionado.
   3. Execute ScaleData, RunPCA, FindNeighbors, FindClusters, RunUMAP como o pipeline padrão introduzido do Seurat, exceto a etapa¹⁷ do NormalizeData.
   4. Ajuste o parâmetro de resolução na etapa FindClusters para modificar o número de clusters, garantindo que eles reflitam com mais precisão o contexto biológico subjacente.
9. Use ferramentas de visualização como DimPlot e FeaturePlot compatíveis com o pacote Seurat. Para comparar grupos que contêm várias amostras por grupo, calcule a porcentagem de cada cluster por sujeito e faça comparações estatísticas. Posteriormente, utilizar modelos matemáticos para análises estatísticas mais sofisticadas¹⁰.

Resultados

Para comparar a viabilidade celular geral, cortamos a amígdala em três pedaços semelhantes e os processamos usando nosso protocolo sob três condições: (1) processamento no mesmo dia, (2) armazenamento noturno a 4 ° C e (3) armazenamento noturno em gelo. A viabilidade entre essas três condições foi bastante semelhante, sem diferença significativa (Figura 1A). Também avaliamos o impacto do processo de descongelamento na viabilidade das células. O método de descongelamento gota a gota que usamo...

Discussão

Em contraste com relatos anteriores de que as amígdalas frescas devem ser processadas dentro de 3 h após a cirurgia¹⁹, descobrimos que as amostras frescas de amígdalas podem manter sua viabilidade quando armazenadas a 4 ° C e processadas em 24 h. Para otimizar a viabilidade celular do tecido da amígdala após o descongelamento do armazenamento de nitrogênio líquido, adotamos o método de descongelamento gota a gota recomendado no sequenciamento de célula única, onde...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Máquinas e instrumentos
3 mL Seringa de Plástico	BD	309657
96 Poços U Placa Inferior	Thermo Scientific	163320
1.2 mL Frascos Criogênicos Corning		430487
Cell strainer 70 µ m Nylon	Falcon	352350
Placa de Cultura de Células (60 mm)	VWR	10062-890
Centrífuga	Thermo Scientific	Sorvall Legend XTR
Benchmark B2000-2 MyBath 2L Tesoura Fina	Benchmark	B2000-2
- Sharp	F.S.T	14060-11
Estojos de Instrumentos de Plástico	F.S.T	20830-05
Citômetro de fluxo espectral, Aurora	Cytek		5L 16UV-16V-14B-10YG-8R
Fórceps Padrão	F.S.T	11000-13
Fórceps Padrão	F.S.T	11000-20
Vi-cell Analisador de viabilidade de célula Blu	Beckman Coulter	C19201
Reagents
0.5 M EDTA pH 8.0 Quality	Biology	351-027-101
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985-023
ACK lysing buffer	Gibco	A10492-01
Mistura antibiótica-antimicótica (Penicilina-Estreptomicina-Anfotericina B Suspensão, 100x)	Gibco	15240-062
tampão brilhante da mancha mais (RUO)	BD	566385
Cantharidin	Sigma	C7632-25MG
tampão da fixação de Cytofix	BD	554655
sulfóxido de dimetilo (DMSO)	Sigma	D8418-250ml
DNAase I	Roche	10104159001
fetal Soro bovino (FBS)	VWR	97068-085
Conjunto de tampão de coloração FoxP3/fator de transcrição	eBioscience	00-5523-00
Gentamicina (50 mg/mL)	Gibco	15750-060
Golgiplug	BD	555029
GolgiSTOP	BD	554724
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Ionomicina	Sigma	I0634-1mg
L-Glutamina (200 mM)	Gibco	25030-081
MEM NEAA (100x)	Gibco	11140-050
Solução de paraformaldeído a 16%, grau EM (PFA)	Microscopia eletrônica   Science	15710	Diluir com PBS
PBS, pH 7,4	Gibco	10010072
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15140-122
Phorbol 12-Miristato 13-Acetato (PMA)	Sigma	P8139-1mg
Recipientes de congelamento controlados por taxa	Millipore	Corning CoolCell FTS30
RPMI (+L-Glutamina)	Gibco	11875-085
Piruvato de Sódio (100 mM)	Gibco	11360-070
Bloqueador de Monócitos True-Stain	BioLegend	426103
Buffers
Meio			de cultura 10% FBS inativado por calor (VWR), 2 nM glutamina, 0.055 mM 2-mercaptoetanol, 1% penicilina/ estreptomicina, 1 mM de piruvato de sódio 10 mM HEPES, 1% de aminoácidos não essenciais em RPMI (+L-Glutamina)
Tampão			2 mM EDTA e 2% de FBS inativado por calor em PBS
Meio			90% de FBS inativado por calor e 10% de tampão
		descongelamento	Tampão de lavagem + 0,1 mg/mL DNaseI
Meio			de amígdalaRPMI suplementado com 5% de FBS inativado por calor, 10 mM de glutamina, 0,05 mg/mL de gentamicina, mistura antibiótico-antimicótica a 1%   (penicilina, estreptomicina e anfotericina B).
Tampão			RPMI (+L-Glutamina) suplementado com 10%  FBS inativado por calor e 10 mM HEPES
Anticorpos e outros regentes para painel de citocinas
Biotina anti-CD107a humano (LAMP-1) Anticorpo	BioLegend	328604	2 μ L em 200 μ L meio de cultura completo por poço. Este anticorpo foi adicionado às células durante a estimulação com PMA/ionomicina.
Coloração de mortos-vivos	100 μ L mistura por poço
LIVE DEAD Blue	Thermo	L23105	1: 800, 0,125 μ L em 100 μ L PBS por poço.
Bloco de monócitos	50 μ L mistura por poço
Tampão bloqueador de monócitos	BioLegend	426103	5 μ L Bloqueador de monócitos True Stain e 45 μ L Buffer FACS por anticorpos
< bem>superfície para mistura de receptores de citocinas
Chemokine mix			μ L/bem
Anti-humano CCR6-BV711	BioLegend	353436	1
Anti-humano CCR7-BV421	BioLegend	353208	1
Anti-humano CXCR3-PE-Cy5	BD	551128	5
Anti-humano CXCR5-BV750	BD	747111	1
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
	18 μ L mistura por poço para receptores de quimiocinas; Adicionar direcionado às células com o tampão
Other mistura de anticorpos de superfície			μ L/bem
Anti-humano CD103-BUV661	BD	749993	2.5
Anti-humano CD14-Spark Blue 550	BioLegend	367148	2.5
Anti-humano CD19-Spark NIR 685	BioLegend	302270	2.5
Anti-humano CD25-BB515	BD	564467	10
Anti-humano CD27- Super Bright 436	Thermo	62-0279-42	5
Anti-humano CD3-BV510	BioLegend	344828	2.5
Anti-humano CD38 APC-Fire810	BioLegend	303550	1
Anti-humano CD4 CF YG584	Cytek	R7-20041	2.5
Anti-humano CD45RA-BUV395	BD	740315	0.6
Anti-humano CD56-BUV737	BD	612766	3.5
Anti-humano CD57-FITC	BioLegend	359604	1.2
Anti-humano CD69-BUV563	BD	748764	1
Anti-humano CD8-BUV805	BD	612889	1.2
Anti-humano FAS-BB700	BD	566542	0.6
Anti-humano HLA-DR APC-Fire 750	BioLegend	307658	2
Anti-humano PD1-BV785	BioLegend	329929	1.2
Anti-humano-CD45-PerCP	Thermo	MHCD4531	1.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
FACS buffer			61
			112 μ L mistura por alvéolo para outros anticorpos de superfície; Adicione diretamente ao buffer de bloco de monócitos (50 μ L) e mistura de receptores de quimiocinas (18 μ L, 50+18+112 = 180 μ L no total por poço)
anticorpos intracelulares de citocinas para painel de citocinas			μ L/bem
Anti-humano Granzyme B-PE	BD		1
Anti-humano IL10-PE-Dazzle 594	BioLegend	506812	1
Anti-humano IL17A-BV605	BioLegend	512326	1
Anti-humano IL2-BV650	BioLegend	500334	3
Anti-humano IL21- Alexa Fluor 647	BD	560493	10
Anti-humano IL4-PerCP Cy5.5	BD	561234	1
Anti-humano Perforin-APC	BioLegend	353312	2.5
Anti-humano TNFa-PE-Cy7	BioLegend	502930	0.1
Anti-IFNγ-Pacific Blue	BioLegend	502522	1
SAv-BUV615	BD	613013	0.25
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
1x tampão de permeabilização	eBioscience	00-5523-00	19.15
	(50 μ L mix por poço)
< forte > anticorpos e outros regentes para painel de fator de transcrição < / forte >
CD40 Anticorpo, anti-humano	Miltenyi Biotec	130-094-133	0,5 μ g/mL de meio de cultura para concentração de trabalho
coloração de mortos-vivos	100 μ L mistura por poço
LIVE DEAD Blue	Thermo	L23105	1: 800, 0,125 μ L em 100 μ L PBS por poço.
Tampão bloqueador de monócitos	BioLegend	426103	5 μ L Bloqueador de monócitos True Stain e 45 μ L Buffer FACS por bem
Anticorpos de superfície para painel de fatores de transcrição
Mistura de receptores de quimiocinas			μ L/bem
Anti-humano CCR6-BV711	BioLegend	353436	1
Anti-humano CCR7-BV421	BioLegend	353208	1
Anti-humano CXCR5-BV750	BD	747111	1
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
	13 μ Mistura L por mistura de anticorpos de superfície <
forte> outras < / forte>			μ L/bem
Anti-humano 4-1BB-PE-CY7	BioLegend	309818	2.5
Anti-humano CD14-Spark Blue 550	BioLegend	367148	2.5
Anti-humano CD19-Spark NIR 685	BioLegend	302270	2.5
Anti-humano CD200-PerCP-eFluor 710	ThermoFisher	46-9200-42	2.5
Anti-humano CD25-PE-Cy5	BioLegend	302608	5
Anti-humano CD3-BV510	BioLegend	344828	2.5
Anti-humano CD38-APC-Fire810	BioLegend	303550	1
Anti-humano CD4-Pacific Blue	BioLegend	317423	1
Anti-humano CD40L-PE	BD		15
Anti-humano CD45RA-BUV395	BD	740315	0.6
Anti-humano CD56-BUV737	BD	612766	3.5
Anti-humano CD69-BUV650	BioLegend	310934	2.5
Anti-humano CD8-BUV805	BD	612889	1.2
Anti-humano HLA-DR APC-Fire 750	BioLegend	307658	2
Anti-humano ICOS-BUV563	BD	741421	1.2
Anti-humano OX40-APC	BioLegend	350008	5
Anti-humano PD1-BV785	BioLegend	329929	1.2
Anti-humano-CD45-PerCP	Thermo	MHCD4531	1.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
FACS buffer			54.1
			117  μ L mistura por alvéolo para outros anticorpos de superfície; Adicionar diretamente ao bloco de monócitos  tampão (50 μ L) e mistura de receptores de quimiocinas (13 μ L, 50+13+117 = 180 μ L no total por poço)
Anticorpos do fator de transcrição para o painel do fator de transcrição	μ L/bem
Anti-humano T-bet-BV605	BioLegend	644817	4
Anti-humano Bcl6-PE-CF594	BD	562401	4
Anti-humano FoxP3-Alexa Fluor 488	BD	560887	1.6
Anti-humano GATA3-BB700	BD	566642	2
Anti-humano Ki67-Alexa Fluor 700	BD	561277	0.4
Anti-humano Rorgt-Alexa Fluor 647	BD	563620	2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)	BD	566385	10
1 x Tampão de permeabilização	eBioscience	00-5523-00	16
			40 μ L mix por well
Software e Pacotes para análise não supervisionada
	Software/package	Version<	strong>Source
1	data.table	1.16.2	A Rede de Arquivos R Abrangente
2	FlowJO	10.9.0	Becton, Dickinson and Company
3	pheatmap	1.0.12	A Rede de Arquivos R Abrangente
4	R	4.3.2	A Rede de Arquivos R Abrangente
5	readxl	1.4.3	A Rede de Arquivos R Abrangente
6	Rstudio	2023.12.1+402	Posit PBC
7	Seurat	5.1.0	A Rede de Arquivos R Abrangente
8	SeuratData	0.2.2.9001	A Rede Abrangente de Arquivos R
9	SpectroFlo	3.0	Cytek
10	tidyverse	2.0.0	A Rede Abrangente de Arquivos R
11	viridis	0.6.5	A Rede Abrangente de Arquivos R