Um Fluxo de Trabalho Prático para a Análise de Dados de Transcriptômica Espacial: da Aquisição de Dados às Análises Avançadas

Resumo

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho reprodutível para análise de dados de transcriptômica espacial, orientando os usuários desde a aquisição de dados públicos e controle de qualidade baseado no Seurat até a integração, detecção de características espaciais, desconvolução de tipos celulares, anotação de regiões de interesse e análise de comunicação célula-célula, com pontos de verificação práticos que apoiam a execução transparente.

Resumo

A transcriptômica espacial (ST) caracteriza a expressão gênica em todo o genoma ao mesmo tempo em que preserva o contexto espacial bidimensional das moléculas de mRNA dentro de seções de tecido, permitindo estudos sobre a arquitetura tecidual e a biologia associada ao microambiente. No entanto, a análise de ST ainda é desafiadora porque a importação de dados, controle de qualidade, integração, desconvolução, estatísticas espaciais e visualização frequentemente exigem múltiplos ambientes de software e escolhas reprodutíveis de parâmetros. Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho computacional prático para conjuntos de dados públicos de ST em R, começando pela aquisição de dados e configuração do software e prosseguindo com o carregamento de dados baseado no Seurat, controle de qualidade, normalização, integração de múltiplas amostras, agrupamento e análise de genes espacialmente variáveis. O fluxo de trabalho aplica então estratégias complementares de desconvolução, incluindo a análise SPOTlight guiada por referência e a modelagem de tópicos não supervisionada com STdeconvolve, seguida por análise espacial de comunicação célula a célula baseada no Giotto e seleção interativa de regiões de interesse (ROI) utilizando uma aplicação personalizada em Python Dash. Ao enfatizar a execução baseada em scripts, justificativas explícitas dos parâmetros, saídas esperadas e pontos de verificação para solução de problemas, o protocolo fornece um framework adaptável para conjuntos de dados padrão de ST baseados em matrizes e plataformas relacionadas após avaliação de parâmetros específicos do conjunto de dados e da plataforma.

Introdução

A transcriptômica espacial (ST) é uma família transformadora de tecnologias que mede a expressão gênica em todo o genoma ao mesmo tempo em que preserva as coordenadas espaciais das moléculas de RNA mensageiro (mRNA) dentro de seções de tecido. Os métodos de ST incluem abordagens baseadas em sequenciamento que utilizam matrizes com códigos de posição e abordagens de imagem in situ que mapeiam sinais transcricionais dentro de microambientes teciduais intactos^1,2. Ao preservar o contexto espacial, a ST permite a análise da arquitetura tecidual, da organização de vizinhanças celulares, da comunicação entre células e de processos biológicos associados ao microambiente que não podem ser totalmente resolvidos após a dissociação do tecido³.

O rápido crescimento dos repositórios públicos de dados de ST criou oportunidades sem precedentes para análise secundária e desenvolvimento de métodos³. Recursos como a base de dados CROST curam centenas de conjuntos de dados transcriptômicos com resolução espacial em múltiplas espécies e plataformas tecnológicas, enquanto coleções especializadas como o STOmicsDB focam em metodologias específicas, tais como o Stereo-seq^4,5. Apesar dessa abundância de dados, a análise computacional permanece desafiadora devido à complexidade das estruturas de dados espaciais, à diversidade de ferramentas analíticas e aos obstáculos técnicos na implementação de fluxos de trabalho reprodutíveis^{6,7,8,9,10,11}.

Para superar as limitações de depender de um único ambiente de software, apresenta-se aqui um fluxo de trabalho computacional integrado que utiliza ferramentas analíticas complementares. Os ecossistemas existentes de análise de ST incluem principalmente Seurat, Giotto e estruturas baseadas em Python, como o Squidpy^6,7,12. Embora ferramentas baseadas em Python, como o Squidpy, ofereçam funcionalidades extensas para análise de grafos espaciais, consolidar o principal fluxo computacional dentro de um único ambiente de linguagem de programação minimiza dificuldades técnicas entre linguagens. Consequentemente, o fluxo principal é implementado principalmente em R para reduzir essas dificuldades técnicas entre linguagens. Neste fluxo de trabalho baseado em R, o Seurat é utilizado para carregamento de dados, controle de qualidade, normalização, redução de dimensionalidade, visualização e integração de múltiplas amostras, refletindo seu uso comum em fluxos de trabalho de transcriptômica única de célula e espacial. O Giotto é então usado para a construção da rede espacial e para a análise de comunicação célula a célula baseada em ligante-receptor. Assim, este fluxo de trabalho conecta o pré-processamento e integração baseados no Seurat à análise espacial baseada no Giotto, mantendo explícita e reprodutível a transferência de dados entre os dois conjuntos de ferramentas.

Dentro desse enfoque, duas estratégias complementares de desconvolução são implementadas: SPOTlight, um método orientado por referência que utiliza dados de scRNA-seq para estimar as proporções de tipos celulares, e STdeconvolve, um método não supervisionado baseado em modelagem de tópicos que identifica padrões transcricionais latentes^8,11. Os resultados fornecem visões complementares da heterogeneidade celular espacial, mas não são tratados como uma validação cruzada quantitativa, a menos que os usuários realizem a análise opcional de concordância descrita no protocolo. Uma aplicação personalizada em Python Dash, Select Spatial Spots, é integrada para anotação interativa de regiões de interesse (ROI) e exporta arquivos de anotação baseados em coordenadas padrão que podem ser utilizados em análises downstream subsequentes.

Quanto à aplicabilidade prática, este fluxo de trabalho destina-se principalmente a dados de ST baseados em matrizes padrão (por exemplo, Visium com resolução de 55 µm) e pode ser adaptado a outros tipos de tecidos após avaliação dos parâmetros. Limitações importantes devem ser consideradas antes da análise. Primeiro, o módulo de desconvolução orientado por referência depende de uma referência de scRNA-seq de alta qualidade e correspondente ao tecido. Segundo, plataformas subcelulares ou próximas da resolução unicelular podem exigir pré-processamento modificado, agregação espacial de bins ou segmentação celular baseada em imagem antes da integração². O conjunto de dados representativo do cólon de camundongo é utilizado como um caso de demonstração para mostrar como o fluxo de trabalho pode avaliar domínios espaciais e a organização tecidual definida por marcadores, e não como evidência de compatibilidade universal da plataforma.

Protocolo

Todos os conjuntos de dados biológicos analisados neste protocolo estão publicamente disponíveis e são usados estritamente para fins de demonstração. Os acessos específicos aos dados e os repositórios de origem são fornecidos nos passos relevantes. Os conjuntos de dados originais foram gerados pelos pesquisadores responsáveis, em conformidade com as diretrizes éticas institucionais aplicáveis a cada estudo de origem. Consulte a Tabela de Materiais para verificar todas as versões necessárias de softwares e pacotes R.

Requisitos de hardware: A memória computacional necessária para este fluxo de trabalho aumenta conforme o número de amostras e pontos analisados. Para um conjunto de dados típico de transcriptômica espacial (por exemplo, aproximadamente 3.000 pontos por amostra em até três amostras), uma estação de trabalho padrão com no mínimo 16 GB de RAM é suficiente para executar o pipeline. No entanto, recomenda-se fortemente 32 GB de RAM ou mais para garantir desempenho e estabilidade ideais, especialmente durante etapas computacionais que exigem alto uso de memória, como a normalização SCTransform e a fatoração de matrizes durante a desconvolução.

1. Aquisição de dados e preparação da estrutura de diretórios

1. Obtenha conjuntos de dados públicos de transcriptômica espacial (por exemplo, acesso GEO GSE169749, com data de submissão em 26 de março de 2021 e última atualização em 6 de março de 2022) e dados de referência de RNA-seq de célula única (por exemplo, acesso GEO GSE264408, com data de submissão em 19 de abril de 2024 e última atualização em 10 de dezembro de 2024).
2. Baixe o arquivo de dados brutos (por exemplo, GSE169749_RAW.tar) do repositório e extraia o arquivo.
   OBSERVAÇÃO: Para o conjunto de dados representativo utilizado neste protocolo, o diretório extraído contém múltiplos arquivos para cada amostra, cujos nomes de arquivo geralmente incorporam o acesso da amostra ao GEO (por exemplo, GSM5213483).
3. Organize os arquivos em uma estrutura de diretórios padronizada compatível com o Seurat Load10X_Espacial função.
   1. Crie um diretório principal de dados (por exemplo, ./data/).
   2. Crie um subdiretório dedicado para cada amostra (por exemplo, ./data/sample_A1/).
   3. Transfira (copie ou mova) os seguintes arquivos essenciais para cada amostra para o subdiretório respectivo.
      1. Coloque o filtered_feature_bc_matrix.h5 arquivo no subdiretório principal da amostra.
      2. Crie um espacial/ subpasta dentro de cada diretório de amostra.
      3. Coloque os seguintes arquivos na espacial/ subpasta: tissue_positions_list.csv.gz, scalefactors_json.json.gz e tissue_hires_image.png.gz.
   4. Descomprima o .gz arquivos na espacial/ pasta. Certifique-se de que os nomes originais dos arquivos permaneçam exatamente conforme exigido pelo Load10X_Espacial função (por exemplo, tissue_positions_list.csv).
      OBSERVAÇÃO: A estrutura final e organizada para o carregamento contínuo deve seguir este padrão, usando a amostra A1 como exemplo:
      ./data/amostra_A1/matriz_bc_caracteristica_filtrada.h5
      ./data/sample_A1/spatial/tissue_positions_list.csv
      ./data/amostra_A1/espacial/fatores_de_escala_json.json
      ./data/sample_A1/spatial/tissue_hires_image.png

2. Configuração do ambiente de software

1. Instale o R (versão 4.4.3 ou superior).
2. Obtenha os scripts de análise (1_ReadSpatialData.R até 8_Giotto_Communication.R) do repositório GitHub (https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow, no commit hash 2d85e18 para fins de reprodutibilidade).
3. Instale os pacotes de R necessários do CRAN e do Bioconductor executando o script setup.R.
   OBSERVAÇÃO: Uma lista abrangente das versões específicas dos pacotes utilizadas neste fluxo de trabalho é fornecida no Tabela de Materiais e também está disponível no session_info.txt arquivo dentro do repositório GitHub associado (https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow).
4. Instalar Giotto Suite executando os comandos de instalação fornecidos na documentação oficial.
   1. Navegue até a URL oficial de instalação para recuperar os scripts de configuração: https://giottosuite.com/articles/installation.html
   2. Inicialize o ambiente Python necessário e as dependências do sistema de acordo com as instruções passo a passo.
5. Instale pacotes adicionais para visualização aprimorada.
   1. Executar: install.packages(c("ggprism", "daltonismo"))
6. Instale o personalizado Selecionar Pontos Espaciais ferramenta. Certifique-se de que o sistema operacional seja Windows, macOS ou Linux, e que a versão do Python instalada seja 3.8 ou superior. Este passo é opcional.
   1. Obtenha a ferramenta acessando o repositório no GitHub (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots, no commit de hash d20946e para fins de reprodutibilidade) e baixando o código-fonte.
   2. Navegue até o diretório da ferramenta e instale as dependências do Python: pip install -r requirements.txt
7. Instale o glmGamPoi pacote ao executar BiocManager::install("glmGamPoi") para acelerar o SCTransform normalização.
   OBSERVAÇÃO: O fluxo de trabalho principal requer apenas os pacotes listados nas etapas 2.1–2.3 e 2.6. O pacote Rfast2 é utilizado para acelerar o cálculo da estatística de Moran's I. Os pacotes opcionais na etapa 2.5 são para gerar gráficos prontos para publicação com um tema no estilo prism (ggprism) e para acessar uma paleta de cores adequada para pessoas com daltonismo (colorBlindness). A ferramenta na etapa 2.6 habilita a funcionalidade de seleção interativa de pontos. Execute o comando sessionInfo() e salve a saída completa do console em um arquivo de texto. Isso documenta as versões exatas dos softwares e as dependências dos pacotes, o que é essencial para garantir a reprodutibilidade a longo prazo.

3. Carregamento dos dados espaciais e controle de qualidade (1_ReadSpatialData.R, 2_SpatialDataQC.R)

1. Leia os dados espaciais em objetos Seurat.
   1. Utilize Read10X_Imagem para carregar manualmente a imagem de tecido de alta resolução, especificando o image.dir e image.name
   2. Uso Load10X_Espacial com o imagem parâmetro definido para o objeto de imagem criado na etapa 3.1.1 para criar o objeto Seurat.
2. Calcular métricas de controle de qualidade.
   1. Calcule a porcentagem de leituras mitocondriais utilizando Conjunto de Recursos Percentual com o padrão ^mt-.
3. Visualize e interprete os dados com base nas métricas de controle de qualidade.
   1. Gerar gráficos de violino de nContagem_Espacial, nFeature_Espacial, e percent.mt usando VlnPlot.
   2. Crie gráficos espaciais dessas métricas utilizando SpatialFeaturePlot para identificar pontos fora da área do tecido.
      OBSERVAÇÃO: Ponto de verificação visual: Pontos fora da área do tecido normalmente exibem contagens baixas de UMI (nContagem_Espacial < 500) e baixa detecção gênica (nFeature_Espacial < 200)
   3. Para fins de demonstração, aplique filtros para remover pontos de baixa qualidade (por exemplo, subset(seurat_obj, subset = nFeature_Spatial > 200 & nCount_Spatial > 500)). Este é um passo opcional.
      OBSERVAÇÃO: O objetivo principal do controle de qualidade (QC) em transcriptômica espacial é identificar e anotar artefatos técnicos, como spots fora do tecido. Para os dados de cólon Visium utilizados na demonstração, nFeature_Spatial > 200 e nCount_Spatial > 500 remove pontos de baixa complexidade/ruído de fundo. Para tecidos com baixo conteúdo de RNA ou seções degradadas, inspecione os gráficos de violino e de características espaciais antes de aumentar os limiares; para tecidos densos ou com alto número de UMI, limiares mais rigorosos podem ser apropriados. Evite filtrar exclusivamente com base em altos valores de expressão, a menos que haja presença de dupletos, dobras no tecido ou artefatos evidentes. O filtro geralmente não é recomendado, pois remove fisicamente localizações espaciais, o que pode comprometer a continuidade da estrutura tecidual em análises espaciais subsequentes.

4. Pré-processamento, integração e agrupamento de dados (3_IntegrationAndClustering.R)

1. Normalizar e pré-processar amostras individuais.
   1. Aplicar a normalização SCTransform a cada amostra separadamente com assay = Spatial.
2. Integrar múltiplas amostras.
   1. Preparar a lista de objetos normalizados por SCT para integração. Garantir que cada objeto tenha um assay "RNA" copiando o assay "Spatial": spatial_list[[1]][["RNA"]] <- spatial_list[[1]][["Spatial"]]
      ​NOTA: Copiar o assay "Spatial" para um slot padrão de assay "RNA" constitui uma solução necessária para garantir compatibilidade com funções de integração downstream originalmente projetadas para objetos Seurat de célula única.
   2. Utilizar SelectIntegrationFeatures e PrepSCTIntegration para identificar características variáveis compartilhadas.
   3. Encontrar âncoras de integração usando FindIntegrationAnchors com normalization.method = "SCT".
   4. Integrar os dados usando IntegrateData com normalization.method = "SCT".
3. Realizar redução de dimensionalidade e agrupamento no assay integrado.
   1. Executar PCA nos dados integrados usando RunPCA.
   2. Determinar o número ótimo de componentes principais (PCs) para análise downstream calculando a variância acumulada explicada. Identificar o ponto de cotovelo de forma programática (por exemplo, o ponto em que a variância acumulada excede 90% e o ganho marginal cai abaixo de 0,1%), utilizando o código em 3_IntegrationAndClustering.R, linhas 36-38. O número resultante de PCs será aqui referido como pc.use.
   3. Executar RunUMAP com dims = 1:pc.use.
   4. Agrupar as células usando FindNeighbors com dims = 1:pc.use e FindClusters com resolution = 0,5. Ajustar a resolução somente após inspecionar a estabilidade dos agrupamentos e a coerência dos genes marcadores.
   5. Realizar análise de expressão diferencial entre grupos-alvo (por exemplo, "B1_colon_d14" versus "A1_colon_d0") usando a função FindMarkers.
      ​NOTA: Ponto de verificação visual: uma integração bem-sucedida exibirá mistura apropriada das amostras no gráfico UMAP, mantendo ao mesmo tempo agrupamentos biologicamente distintos.
4. Identificar genes espacialmente variáveis.
   1. Para cada amostra original, executar FindSpatiallyVariableFeatures utilizando o método "moransi" no assay "SCT" para calcular a autocorrelação espacial.

5. Pré-processamento de dados de referência de célula única (4_scDataPreProcessing.R)

1. Leia a matriz de contagem de RNA-seq de célula única usando Read10X e crie um objeto Seurat.
2. Realize controle de qualidade, normalização e agrupamento padrão.
   1. Calcule a porcentagem de leituras mitocondriais (percent.mt) e filtre as células (por exemplo, nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 7500 & percent.mt < 25).
   2. Normalize os dados usando SCTransform, definindo vars.to.regress = "percent.mt".
   3. Execute PCA, UMAP e agrupe as células usando o método dinâmico de seleção de componentes principais descrito na etapa 4.3.2.
3. Realize a anotação dos tipos celulares.
   1. Calcule os escores de módulo para genes marcadores canônicos de tipos celulares usando AddModuleScore.
   2. Anote os agrupamentos com base nos escores de módulo e na biologia conhecida. Alternativamente, importe anotações pré-computadas dos metadados.

6. Desconvolução Guiada por Referência com SPOTlight (5_SPOTlight_Deconv.R)

1. Preparar os dados para o SPOTlight.
   1. Converter o objeto Seurat de célula única anotado e o objeto Seurat espacial em objetos SingleCellExperiment.
   2. Normalizar os dados de célula única por log utilizando logNormCounts.
2. Executar a desconvolução SPOTlight.
   1. Identificar genes hipervariáveis (HVGs) nos dados de célula única utilizando modelGeneVar e getTopHVGs.
   2. Calcular os genes marcadores de tipo celular usando scoreMarkers e filtrar por marcadores de alta qualidade (por exemplo, média.AUC > 0,8).
   3. Reduzir a amostragem da referência de célula única para cada tipo celular a um número gerenciável (por exemplo, 50 células) para diminuir o tempo computacional.
   4. Executar a desconvolução utilizando a função SPOTlight com weight_id = "média.AUC", group_id = "cluster" e gene_id = "gene".
3. Visualizar e exportar os resultados.
   1. Extrair a matriz resultante da desconvolução (proporções de tipos celulares por ponto).
   2. Utilizar plotSpatialScatterpie para visualizar a composição celular nas coordenadas espaciais.
   3. Adicionar os resultados da desconvolução aos metadados do objeto Seurat espacial usando AddMetaData. Resultado esperado: uma matriz de desconvolução com colunas de proporção de tipos celulares para cada ponto espacial, gráficos scatterpie espaciais mostrando a composição celular local e um objeto Seurat contendo as proporções de desconvolução como metadados.

7. Desconvolução independente de referência com STdeconvolve (7_STdeconvolve.R)

1. Prepare os dados espaciais.
   1. Extraia a matriz de contagem bruta do objeto espacial Seurat utilizando GetAssayData com slot = "contagens".
   2. Remova spots e genes de baixa qualidade utilizando cleanCounts de STdeconvolve (por exemplo, min.lib.size = 100).
2. Identificar os tipos celulares latentes.
   1. Filtrar ainda mais o conjunto de dados para genes expressos em uma fração mínima de pontos usando restringirCorpus por exemplo, removerAcima=1,0, removeBelow = 0,05).
   2. Ajuste um modelo de Alocação Latente de Dirichlet (LDA) em uma variedade de números potenciais de tópicos (K) (por exemplo, Ks = seq(2, 9, por = 1)) utilizando fitLDA.
   3. Selecione o modelo ideal com base na perplexidade mínima utilizando modelo ideal com opt = "min".
3. Analisar e visualizar os resultados.
   1. Extraia as proporções de tipos celulares (tópico) (theta) e os perfis gênicos (beta) do modelo ótimo utilizando getBetaTheta.
   2. Para auxiliar na interpretação biológica dos tópicos desconvolutados, importe anotações de regiões de interesse (ROI) geradas pelo "Selecionar Pontos Espaciais" ferramenta (ver etapa 9.3.3). Utilize essas anotações como o parâmetro grupos no vizTodosTópicos função para projetar as proporções de tipos celulares desconvolutas de volta nas coordenadas espaciais e codificar por cores os pontos conforme sua ROI. Este é um passo opcional.
      OBSERVAÇÃO: A saída esperada é que o STdeconvolve retorne valores de theta representando as proporções de tópicos por ponto e valores de beta representando os perfis gênicos para cada tópico. Caso os usuários desejem comparar quantitativamente os resultados não supervisionados do STdeconvolve com as saídas orientadas por referência do SPOTlight (do Passo 6), eles podem exportar ambas as matrizes de proporção (theta do STdeconvolve e a matriz do SPOTlight) e calcular métricas de correlação ou concordância por ponto (por exemplo, correlação de Pearson ou de Spearman) utilizando funções padrão do R. A comparação quantitativa entre SPOTlight e STdeconvolve é opcional e não é necessária para a execução do fluxo de trabalho principal; contudo, as matrizes de saída relevantes estão disponíveis nos Passos 6.3.1 e 7.3.1 para usuários que desejem realizar tal análise.

8. Comunicação espacial entre células usando o Giotto(8_Giotto_Communication.R)

1. Converter o objeto Seurat em um objeto Giotto.
   1. Utilize a função createGiottoObject, fornecendo a matriz de contagens brutas e as coordenadas espaciais.
2. Pré-processar o objeto Giotto e adicionar os resultados da desconvolução.
   1. Normalize os dados utilizando normalizeGiotto.
   2. Adicione as anotações de tipos celulares (por exemplo, o tipo celular principal obtido pela desconvolução SPOTlight) aos metadados celulares usando addCellMetadata.
3. Inferir comunicação célula-célula informada espacialmente.
   1. Crie uma rede espacial utilizando createSpatialNetwork com method = "Delaunay" e name = "Delaunay_network".
   2. Carregue uma base de dados de ligante-receptor no ambiente R. Certifique-se de que o objeto carregado esteja formatado como um quadro de dados com duas colunas distintas representando os símbolos gênicos do ligante e do receptor (por exemplo, uma rede de camundongo pré-compilada do Zenodo: https://zenodo.org/api/records/15168114/files/lr_network_mouse.csv/content, versão v6, publicada em 7 de abril de 2025).
   3. Execute exprCellCellcom com cluster_column = "celltype_major" para identificar interações significativas de ligante-receptor entre tipos celulares que estão em proximidade espacial. Resultado esperado: uma tabela contendo pares de ligante-receptor, combinações de tipos celulares fonte e alvo, valores de log2 de mudança de razão e valores de P ajustados; mantenha as interações significativas (por exemplo, p.adj < 0,05) para visualização.

9. Seleção interativa de pontos com seleção de pontos espaciais (6_SelectSpatialSpots.R)

1. Preparar os dados para a ferramenta interativa.
   1. Extrair as coordenadas espaciais do objeto Seurat utilizando GetTissueCoordinates.
2. Formatar e exportar os dados.
   1. Formatar o quadro de dados de coordenadas para conter exatamente os cabeçalhos das colunas: CELL_ID, X e Y.
   2. Exportar o quadro de dados formatado para um arquivo CSV.
3. Realizar a análise de região de interesse (ROI).
   1. Iniciar a aplicação personalizada Select Spatial Spots no Dash e carregar o arquivo CSV.
   2. Selecionar interativamente os pontos com base na localização espacial.
   3. Exportar a lista de pontos selecionados e seus rótulos de grupo/ROI atribuídos como um novo arquivo CSV. Resultado esperado: um arquivo CSV com identificadores de pontos, coordenadas X/Y e rótulos de grupo/ROI atribuídos que podem ser associados novamente ao objeto Seurat por meio de CELL_ID.

Resultados

A implementação do fluxo de trabalho e a integração de dados ilustram as principais características dos tecidos

O fluxo de trabalho computacional foi aplicado a dados de transcriptômica espacial do cólon de camundongo para ilustrar as saídas esperadas em cada estágio analítico. Conforme representado no esquema do fluxo de trabalho (Figura 1), o pipeline iniciou-se com a aquisição de dados e controle de qualidade, em que os gráficos espaciais de características delimitaram os limites do tecido (Figura 2A,B). Em seguida, utilizou-se o fluxo de trabalho de integração baseado em âncoras do Seurat para reduzir os efeitos técnicos de lote, preservando ao mesmo tempo a variação biológica interpretável. Visualizações UMAP mostraram o alinhamento das amostras e os padrões de agrupamento espacial após a integração (Figura 2C,D). A seleção quantitativa e dinâmica de componentes principais (PCs) com base na variância cumulativa foi implementada para orientar a redução dimensional e o agrupamento subsequente (ver Figura Suplementar 1). A análise de mapa de calor de genes marcadores revelou perfis transcricionais distintos subjacentes aos agrupamentos espaciais (Figura 2E).

Para avaliar se os agrupamentos computacionais eram consistentes com a arquitetura anatômica conhecida da histologia do cólon, os perfis de expressão de genes marcadores canônicos específicos de camada foram analisados. A camada do epitélio mucoso mostrou expressão de marcadores de células epiteliais, incluindo Epcam e Krt8, juntamente com o marcador de células caliciformes Muc2. Marcadores mesenquimais e estromais, como Col1a1 e Vim, identificaram a lâmina própria e as regiões submucosas, enquanto a camada externa da muscularis própria foi indicada por genes estruturais de músculo liso, como Acta2 e Tagln. A restrição espacial desses marcadores associados a linhagens sustenta a interpretação de que o fluxo de trabalho de integração e agrupamento preservou as principais laminações histológicas do tecido colônico ao longo do eixo mucosa-muscularis (ver Supplementary Figure 2).

Após a validação dos agrupamentos, foi realizada uma análise diferencial de expressão gênica para identificar genes diferencialmente expressos (DEGs) entre as condições experimentais (Figura 2F,G). Além disso, genes espacialmente variáveis foram identificados utilizando a estatística de Moran's I, destacando genes com distribuição espacial significativamente não aleatória ao longo do tecido (Figura 2H).

As desconvolução celular e as redes de interação espacial revelam a microorganização do tecido

O processamento dos dados de referência de RNA-seq de célula única gerou anotações apoiadas por filtragem de controle de qualidade (Figura 3A), agrupamento não supervisionado (Figura 3B), validação de genes marcadores (Figura 3C) e concordância com anotações independentes (Figura 3D). A composição celular (Figura 3E) orientou a estratégia de subamostragem para a desconvolução. O SPOTlight estimou as proporções de tipos celulares guiadas por referência em pontos espaciais (Figura 4A,B), enquanto o STdeconvolve forneceu uma visão baseada em modelagem de tópicos não supervisionada dos padrões celulares espaciais (Figura 5B). A ferramenta personalizada Select Spatial Spots forneceu contexto histológico para esses padrões (Figura 5A). Por fim, utilizando as atribuições de tipos celulares desconvolutas, a análise de comunicação espacial identificou interações ligante-receptor entre grupos de tipos celulares proximais no espaço (Figura 6A,B).

Observações de solução de problemas a partir da otimização do protocolo

Durante a otimização do protocolo, diversos problemas foram identificados, o que orientou a definição de pontos de verificação práticos. Resultados subótimos de desconvolução ocorreram quando as referências de célula única não correspondiam adequadamente ao contexto tecidual, indicando a necessidade de utilizar dados de scRNA-seq compatíveis com o tecido e a espécie, quando disponíveis. Tentativas iniciais de agrupamento com parâmetros padrão nem sempre resolveram as estruturas biológicas esperadas; a análise da seleção de componentes principais (PC), da resolução do agrupamento e da coerência dos genes marcadores ajudou a identificar domínios com interpretação espacial alinhados à anatomia do tecido. Essas observações fornecem exemplos práticos de como os usuários podem diagnosticar problemas analíticos comuns durante a execução do fluxo de trabalho.

Figura 1: Fluxo de trabalho para análise integrada de transcriptômica espacial. Representação esquemática do fluxo analítico, desde a aquisição e pré-processamento dos dados até as análises espaciais avançadas. Os principais passos incluem: (1) Carregamento dos dados, controle de qualidade e integração de múltiplas amostras utilizando o Seurat; (2) Agrupamento espacial e detecção de genes com variabilidade espacial; (3) Desconvolução de tipos celulares via métodos baseados em referência (SPOTlight) e não supervisionados (STdeconvolve); (4) Análise espacial de comunicação célula-célula com Giotto e seleção interativa de região de interesse utilizando uma ferramenta personalizada, Selecionar Pontos EspaciaisOs resultados de todos os módulos são sintetizados para obter insights biológicos sobre a arquitetura tecidual e o microambiente celular. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 2: Integração de dados, agrupamento e análise de expressão diferencial. (A,B) Métricas de controle de qualidade para as amostras espaciais A1 e B1, mostrando as distribuições de contagens gênicas, contagens de UMI e porcentagens de genes mitocondriais. (C) Visualização UMAP dos dados integrados de transcriptômica espacial coloridos pela origem da amostra (esquerda) e pela identidade do agrupamento (direita). (D) Projeção espacial das identidades dos agrupamentos sobre seções de tecido. (E) Mapa de calor dos principais genes marcadores para cada agrupamento espacial. (F) Gráfico de vulcão exibindo genes diferencialmente expressos entre as condições A1_colon_d0 e B1_colon_d14. (G) Padrões de expressão espacial de genes representativos diferencialmente expressos ao longo de seções de tecido. (H) Mapas de expressão espacial dos principais genes espacialmente variáveis identificados via estatística de Moran's I, com os dois painéis à esquerda exibindo genes da amostra A1_colon_d0 e os dois painéis à direita exibindo genes da amostra B1_colon_d14. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 3: Processamento e anotação de dados de referência de célula única. (A) Métricas de controle de qualidade para dados de referência de scRNA-seq antes e após a filtragem. (B) Visualização UMAP dos dados de scRNA-seq colorida por agrupamentos não supervisionados. (C) Gráfico de pontos mostrando os escores de expressão dos genes marcadores canônicos de tipos celulares ao longo dos agrupamentos. (D) Visualização UMAP anotada dos dados de scRNA-seq com os principais tipos celulares identificados. (E) Composição celular do conjunto de dados de referência de scRNA-seq. A linha vermelha tracejada indica o limiar de subamostragem (n = 50 células por tipo) aplicado durante a desconvolução SPOTlight para equilibrar eficiência computacional e representação de tipos celulares. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 4: Desconvolução espacial da heterogeneidade celular. (A,B) Gráficos espaciais em pizza a partir da desconvolução SPOTlight mostrando a composição proporcional dos principais tipos celulares em cada ponto para as amostras A1 (A) e B1 (B). (C) Distribuição espacial representativa de células B nas amostras A1 (esquerda) e B1 (direita), demonstrando os padrões de localização resolvidos espacialmente de uma população específica de células imunes identificada por meio da desconvolução. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 5: Análise interativa de região de interesse e comparação da desconvolução não supervisionada. (A) Interface da ferramenta personalizada "Selecionar Pontos Espaciais" mostrando a seleção interativa de regiões correspondentes ao cólon proximal, cólon distal e outros domínios teciduais. (B) Visualização espacial em gráfico de pizza mostrando os resultados da desconvolução não supervisionada (STdeconvolve) para a amostra A1, com pontos coloridos de acordo com as regiões anotadas manualmente em (A), ilustrando a correspondência entre a anotação baseada em histologia e as distribuições computacionais de tópicos celulares. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Figura 6: Redes espacialmente informadas de comunicação célula-célula. (A,B) Redes de interação ligante-receptor inferidas pelo Giotto para as amostras A1 (A) e B1 (B). Os nós representam tipos celulares, as arestas representam pares significativos de ligante-receptor (FDR < 0,05) e a espessura das arestas corresponde à intensidade da interação. Para garantir comparabilidade e clareza na visualização, um limiar uniforme de significância (FDR < 0,05) foi aplicado em todas as amostras, e as 20 principais interações classificadas pelo log2FC são exibidas para cada condição. As redes destacam padrões específicos de comunicação entre tipos celulares no contexto espacial do tecido colônico. Clique aqui para visualizar uma versão ampliada desta figura.

Figura Suplementar 1: Avaliação quantitativa da otimização de parâmetros para redução de dimensionalidade. O gráfico de cotovelo demonstra a abordagem programática do fluxo de trabalho para selecionar dinamicamente o número ideal de componentes principais (PCs). A seleção é calculada com base nos limiares de desvio padrão acumulado e variância marginal, representados pela linha vertical vermelha, com o objetivo de capturar a variância biológica enquanto reduz o ruído técnico antes da agrupamento subsequente.Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 2: Validação do agrupamento espacial utilizando marcadores específicos das camadas colônicas canônicas. (A) Gráfico de pontos mostrando a expressão enriquecida de marcadores epiteliais, estromais e de músculo liso nos agrupamentos computacionais. (B) Gráficos de características espaciais mapeando marcadores representativos (Epcam, Col1a1, Acta2) de volta às coordenadas do tecido.Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho computacional abrangente para análise de dados de transcriptômica espacial, equilibrando profundidade analítica com acessibilidade prática. A abordagem passo a passo orienta pesquisadores ao longo do pipeline analítico completo, desde a aquisição inicial dos dados até análises espaciais avançadas, enfatizando pontos críticos de decisão e armadilhas potenciais.

Várias etapas do protocolo merecem atenção especial devido ao seu impacto nos resultados subsequentes. Os limiares de controle de qualidade e filtragem devem ser cuidadosamente ajustados de acordo com os tipos específicos de tecido e plataformas tecnológicas, pois uma filtragem excessivamente rigorosa pode eliminar pontos biologicamente relevantes, enquanto limiares mais permissivos podem introduzir ruídos técnicos. A escolha do método de normalização influencia significativamente os resultados de agrupamento e de expressão diferencial. Por exemplo, o pipeline utiliza o SCTransform em vez da normalização logarítmica padrão porque o SCTransform tem demonstrado modelar e reduzir a variação técnica relacionada à profundidade de sequenciamento e a outros efeitos técnicos em fluxos de trabalho de célula única e espaciais^14,15. Durante a integração, a seleção de características de integração e dos parâmetros de resolução exige consideração cuidadosa para equilibrar a força da integração com a preservação do sinal biológico. Para a identificação de genes espacialmente variáveis, o Índice de Moran foi escolhido pela escalabilidade computacional e adequação à análise de autocorrelação espacial em dados baseados em matrizes, embora chamadores alternativos, como o SPARK, possam ser considerados dependendo do tamanho do conjunto de dados e dos objetivos do estudo¹⁶.

O componente de solução de problemas deste fluxo de trabalho concentra-se em problemas comuns de interoperabilidade que ocorrem ao passar saídas de um pacote para outro. Em vez de depender de uma única etapa genérica de conversão, o fluxo de trabalho utiliza conversões personalizadas de formato em cada interface de software: dados espaciais de contagem são copiados para um espaço padrão de ensaio de RNA antes da integração no Seurat; objetos de referência do Seurat e de célula única são convertidos em objetos SingleCellExperiment para o SPOTlight; matrizes espaciais de contagem são reformatadas para o STdeconvolve; contagens derivadas do Seurat, coordenadas e metadados de tipos celulares são convertidos em um objeto Giotto para análise de comunicação entre células; e anotações de ROI provenientes do Select Spatial Spots são exportadas como arquivos CSV com CELL_ID, coordenadas X/Y e rótulos de grupo, para que possam ser mapeadas de volta ao objeto Seurat. Essas etapas ajudam os usuários a identificar e corrigir problemas comuns, como espaços de ensaio incompatíveis, identificadores de spots não correspondentes, colunas de metadados ausentes, formatação incorreta de coordenadas e discrepâncias nos símbolos gênicos de ligante-receptor.

Um recurso adicional deste fluxo de trabalho é o uso de duas estratégias complementares de desconvolução, em vez de depender de um único algoritmo. O SPOTlight utiliza referências prévias de scRNA-seq para estimativa orientada por referência das proporções de tipos celulares, enquanto o STdeconvolve permite a descoberta livre de referência de tópicos transcricionais latentes. No conjunto de dados demonstrativo, os tópicos do STdeconvolve alinharam-se com regiões definidas histologicamente (Figura 5B), apoiando a interpretabilidade biológica. Uma comparação quantitativa direta entre os dois métodos não foi realizada neste protocolo; os usuários que desejarem compará-los com seus próprios dados podem seguir a estrutura fornecida na etapa 7.3.2 do protocolo. Além disso, o protocolo favorece a usabilidade e a rastreabilidade ao utilizar scripts para funções principais, ao mesmo tempo que oferece uma interface gráfica (Selecionar Pontos Espaciais) para o isolamento intuitivo de regiões de interesse (ROI).

A integração entre Seurat e Giotto permite que o fluxo de trabalho combine o pré-processamento e a integração baseados no Seurat com as estatísticas espaciais e a análise de redes baseadas no Giotto. O Seurat oferece um ambiente consolidado para pesquisadores com experiência em scRNA-seq e suporta integração de múltiplas amostras, enquanto a transferência dos dados harmonizados para o Giotto possibilita a construção de redes espaciais e a análise de ligantes-receptores. Esse design permite aos usuários aproveitar as funcionalidades comprovadas de ambas as plataformas, sem implicar que tenham sido comparadas diretamente com Squidpy ou outras ferramentas neste contexto. Para comunicação célula-célula, foi utilizada a inferência de ligante-receptor baseada na rede de Delaunay do Giotto, pois incorpora a adjacência espacial dentro do mesmo ambiente analítico; outras ferramentas, como o CellChat, fornecem bancos de dados de sinalização extensos, mas não são avaliadas neste protocolo¹⁷.

Várias limitações devem ser consideradas. A abordagem de desconvolução baseada em referência depende criticamente da disponibilidade de referências de célula única de alta qualidade e correspondentes. Além disso, as suposições fundamentais por trás da análise de comunicação entre células baseiam-se na coexpressão de transcritos como um indicador de interação física entre proteínas, exigindo posterior validação experimental. Por fim, este fluxo de trabalho foi desenvolvido principalmente para conjuntos de dados Visium padrão. À medida que a área avança em direção a tecnologias de resolução quase de célula única, como o Visium HD, as considerações analíticas mudarão; dados de maior resolução podem exigir parâmetros diferentes de pré-processamento e reduzir a necessidade absoluta de desconvolução de spots. Para adaptar este fluxo de trabalho a conjuntos de dados Visium HD, os bins de alta resolução podem ser computacionalmente agregados em bins espaciais maiores, ou os módulos de desconvolução de spots podem ser ignorados em favor de segmentação celular baseada em imagem¹⁸.

Essas características sugerem uma aplicabilidade potencial em diversos domínios biológicos, incluindo biologia do desenvolvimento, neurociência, pesquisa em câncer e imunologia^19,20,21,22. O design modular permite que pesquisadores adaptem componentes específicos às suas necessidades, seja com foco na identificação de domínios espaciais, comunicação celular ou especialização regional. À medida que as tecnologias espaciais continuam a evoluir e os conjuntos de dados se expandem, este protocolo fornece uma base que pode ser ampliada para incorporar novos métodos analíticos e responder a questões biológicas emergentes.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
ggplot2	Posit Software, PBC	v4.0.0(CRAN)	Visualização avançada de dados
Giotto	Dries Lab	v4.2.2 (GitHub)	Análise espacial de redes e comunicação entre células
patchwork	Thomas Lin Pedersen	v1.3.2 (CRAN)	Composição e organização de gráficos
R software	R Foundation for Statistical Computing	v4.4.3	Ambiente principal de execução (macOS aarch64)
scater	Davis McCarthy et al.	v1.34.1 (Bioconductor)	Controle de qualidade e visualização em nível de célula única
scran	Aaron Lun et al.	v1.34.0 (Bioconductor)	Modelagem de variância em células únicas e detecção de marcadores
Select Spatial Spots (Ferramenta Python personalizada)	LeafLight	v1.0.0 (GitHub)	Seleção interativa de regiões de interesse espaciais (ROI) (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots)
Seurat	Satija Lab	v5.3.0 (CRAN)	Pré-processamento, integração e agrupamento de dados espaciais
SeuratObject	Satija Lab	v5.2.0 (CRAN)	Estruturas de dados para dados de célula única e espaciais
SingleCellExperiment	Equipe Núcleo do Bioconductor	v1.28.1 (Bioconductor)	Contêiner padronizado para scRNA-seq
SPOTlight	Marc Elosua-Bayes et al.	v1.10.0 (Bioconductor)	Desconvolução espacial guiada por referência
Stdeconvolve	Laboratório de Jean Fan	v1.3.2 (Bioconductor)	Modelagem latente não supervisionada por tópicos
tidyverse	Posit Software, PBC	v2.0.0 (CRAN)	Suporte principal para manipulação e formatação de dados