Uma Plataforma Digital de Eletroporação Microfluídica para Edição do Genoma CRISPR de Baixa Entrada e Transfecção de mRNA em Células T em Suspensão e Modelos de Células 3D

Resumo

Este protocolo descreve a edição miniaturizada do genoma CRISPR–Cas9 do receptor TCRα/β em células T humanas primárias usando 'DMF-ection', uma plataforma de eletroporação microfluídica digital (DMF). O método permite edição gênica paralela, de baixa entrada e alta viabilidade, e é ainda mais adaptável para a entrega de mRNA em esferoides 3D multicelulares.

Resumo

A eletroporação microfluídica digital (DMF) permite a manipulação genética precisa e de baixo volume das células de mamíferos, minimizando a entrada celular em até 100 vezes e preservando a viabilidade. Este estudo apresenta um fluxo de trabalho de transfecção baseado em DMF de alta produtividade para a eliminação mediada por CRISPR do locus TRAC em células T em suspensão humana primária e para a transfecção de mRNA de esferoides HEK293T tridimensionais. Utilizando RNAs guia CRISPR depositados espacialmente e montagem de ribonucleoproteína (RNP) no cartucho, a perturbação eficiente do locus TRAC foi alcançada em populações de células T CD4⁺ e CD8⁺ usando apenas 10.000 células por condição, com viabilidade pós-edição superior a 85%. Caracterizações biofísicas usando análises induzidas por fluxo e dispersão de Taylor revelaram que aditivos poliméricos estabilizam complexos Cas9–sgRNA sob condições de tampão de eletroporação, apoiando a edição reprodutível em volumes submicrolitros. O fluxo de trabalho foi ainda adaptado para aplicações 3D ao entregar mRNA EGFP em esferoides HEK293T intactos, resultando em fluorescência robusta e espacialmente uniforme sem prejudicar o crescimento ou a morfologia dos esferoides. Juntos, esses resultados demonstram que a eletroporação por DMF possibilita a edição eficiente do genoma e a entrega de mRNA tanto em células imunes em suspensão quanto em esferoides multicelulares. Essa plataforma oferece uma solução escalável e de baixa entrada para aplicações em terapia com células CAR-T, genômica funcional e modelos celulares 3D avançados.

Introdução

A edição gênica em células humanas primárias é cada vez mais central tanto para o desenvolvimento terapêutico quanto para a pesquisa básica, incluindo aplicações em imunoengenharia, modelagem de doenças raras e genômica^{funcional 1}. Embora a eletroporação permita uma edição genômica altamente eficiente, sistemas convencionais baseados em cuvetas normalmente exigem até milhões de células por condição, restringindo seu uso para amostras derivadas de pacientes e populações imunes^{raras 2}. Além disso, esses sistemas são pouco adequados para triagem em grande escala devido a limitações em taxa de transferência, automação e consumo de^{reagentes 3}.

A eletroporação microfluídica emergiu como uma abordagem promissora para edição genômica de baixa entrada⁴. No entanto, a maioria das plataformas existentes depende de arquiteturas de fluxo contínuo que envolvem manuseio complexo de fluidos, flexibilidade limitada na mistura de reagentes e requisitos relativamente altos de célula por condição. Em contraste, a microfluídica digital (DMF) permite a manipulação ativa de gotículas discretas em escala de nanolitros em uma matriz plana de eletrodos, possibilitando controle preciso sobre a composição da reação, o tempo e a localização espacial. Este formato plug-and-play baseado em gotículas é bem adequado para fluxos de trabalho de baixo volume e alta produtividade, onde a conservação de células primárias e reagentes é^{essencial 5}.

Trabalhos recentes demonstraram a viabilidade da entrega intracelular baseada em DMF usando arquiteturas de eletroporação tri-gotas que geram campos elétricos localizados e de baixa corrente para entrega eficiente de RNP e mRNA, minimizando o estresse térmico^{e eletroquímico 6,7,8}. Com base nessa base, foi desenvolvida uma plataforma de eletroporação DMF de próxima geração, denominada 'DMF-ection', com 48 sítios de reação endereçáveis de forma independente, compatibilidade total de automação e fabricação escalável de^{cartuchos 9} (Figura 1). O cartucho DMF consiste em uma placa inferior de PCB e uma placa plástica superior separadas por uma junta, montadas por encaixes de alinhamento em uma única orientação correta (Figura 1A). O layout 48-plex está organizado em oito famílias idênticas (Figura 1A–H), cada uma contendo seis sítios de eletroporação endereçáveis independentemente, suportando até 48 condições de edição paralela por cartucho (Figura 1B). Bibliotecas de RNA-guia são depositadas na superfície do substrato usando um dispensador acústico antes da montagem do cartucho. A precisão posicional da deposição foi confirmada em todos os 48 locais, com posições de queda agrupadas dentro de um desvio submilimétrico do ponto médio do eletrodo (Figura 1C), apoiando a montagem confiável de RNP no cartucho. Após o carregamento, células e gotículas de eletrodos líquidos são acionadas no cartucho para formar a geometria de eletroporação tri-gota (Figura 1D). Após a eletroporação, as células são descarregadas em placas de cultura para recuperação e análise a jusante, incluindo citometria de fluxo, sequenciamento e microscopia (Figura 1E). Esse sistema permite a edição genômica de alta eficiência usando até 100 vezes menos células do que métodos padrão baseados em cuvettes, ampliando significativamente o acesso à engenharia genômica em aplicações de baixa entrada e alta produtividade.

Este estudo avalia o desempenho da plataforma ao entregar múltiplas cargas biomoleculares, incluindo mRNA e complexos ribonucleoproteicoínos (RNP) CRISPR–Cas9, alcançando transfecção eficiente e perturbação gênica. Além das células T primárias, a DMF-ection fornece uma estrutura generalizável para a entrega de ácidos nucleicos em estruturas multicelulares complexas. Esferoides tridimensionais (3D) e modelos do tipo organoide impõem barreiras significativas à penetração de reagentes devido à sua arquitetura e fragilidade, e abordagens convencionais de eletroporação frequentemente interrompem a morfologia ou geram entrega heterogênea. Para avaliar se os mesmos princípios miniaturizados de eletroporação usados na edição de células T se estendem a tecidos estruturados, o fluxo de trabalho DMF foi aplicado a esferoides de HEK293T 3D. Esses experimentos demonstraram que a eletroumedição baseada em DMF pode posicionar suavemente esferoides intactos dentro de geometrias de três gotículas e suportar a entrega uniforme de mRNA, preservando a estrutura e o crescimento. Embora esses resultados estejam fora do protocolo primário de células T descrito aqui, eles ilustram a aplicabilidade mais ampla da eletroporação programável de DMF para sistemas celulares 3D emergentes relevantes para descoberta de fármacos e modelagem de doenças.

Protocolo

As células T humanas primárias usadas neste protocolo foram obtidas de fornecedores comerciais sob consentimento informado do doador e em conformidade com as diretrizes institucionais, éticas e regulatórias aplicáveis. Todo o manuseio de materiais biológicos de origem humana foi realizado de acordo com os protocolos institucionais de biossegurança. Os pesquisadores que implementam este protocolo são responsáveis por garantir que o uso de células humanas primárias esteja em conformidade com os requisitos do conselho de revisão institucional local (IRB) ou comitê de ética, regulamentos de biossegurança aplicáveis e qualquer legislação nacional ou regional relevante que rega o uso de material biológico humano. Nenhuma informação identificável pelo paciente foi associada ao material celular utilizado neste estudo.

1. Preparação e ativação das células T humanas primárias

1. O descongelamento criopreservou rapidamente células T primárias humanas CD3⁺ em um banho-maria a 37 °C. Transfira as células para um meio basal de células T pré-aquecidas e centrifuge a 180 × g por 10 minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda a pastilha em meio fresco.
2. Determine a concentração e viabilidade celular usando um contador automático de células.
3. Ressuspenda células a 1 × 10⁶ células/mL em meio de cultura de células T suplementado com um estímulo ativador de células T CD3/CD28 com anticorpo tetramérico solúvel (segundo instruções do fornecedor) e 200 IU/mL de IL-2. Incubar células por 72 horas a 37 °C, 5% CO₂.
   NOTA: Mantenha a densidade celular entre 0,5–2 × 10⁶ células/mL durante a ativação. Realizar ativação em placas U-bottom de 96 poços para otimizar a eficiência do contato célula-ativador e da ativação.

2. Preparação de manchas de RNA-guia no substrato do DMF (spotting acústico do dispensador)

1. Reconstituir sgRNA liofilizado em água livre de nuclease para uma concentração de estoque de 100 μM. Em um tubo separado, prepare um estoque de 100 mg/mL de ácido poli-L-glutâmico (PGA, sal de sódio, MW 15.000–50.000 Da) em água livre de nuclease. Combine estoque de sgRNA e PGA em uma razão de volume 5:4 (sgRNA: PGA) que resulta em uma concentração final de sgRNA de 55,6 pmol/μL e uma concentração final de PGA de 44,4 mg/mL em água livre de nuclease. Vortex brevemente e centrifugar a 1.000 × g por 30 s e aliquotas em volumes descartáveis, armazenando alíquotas não utilizadas a −80 °C por até 6 meses.
   NOTA: Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.
2. Adicione a mistura guia-PGA a uma placa de fonte acústica de baixo volume morto em poços correspondentes ao layout desejado do local de reação.
3. Transfira 40 nL (equivalente a 2,2 pmol sgRNA) da mistura guia-PGA para cada região de detecção alvo do substrato DMF usando um dispensador acústico calibrado.
   NOTA: A 55,6 pmol/μL, 40 nL entrega 2,2 pmol sgRNA por local (55,6 × 0,040 = 2,22 pmol). Guias secas são reconstituídas durante a fusão de gotas no cartucho; A resuspensão completa é confirmada pela eficiência consistente de edição entre os sites.
4. Em um armário de segurança biológica, deixe as gotículas manchadas secarem completamente ao ar em temperatura ambiente até que não reste líquido visível (aproximadamente 5 min).
   NOTA: Não use fluxo de ar forçado ou calor, pois isso pode desalojar ou degradar o RNA guia.
5. Montar o cartucho DMF.
   1. Em um armário de segurança biológica, alinhe a placa superior sobre o substrato manchado combinando as características assimétricas de encaixe plástica da placa superior com as ranhuras na placa inferior. Aplique pressão uniforme e simultânea ao longo das bordas curtas até que um estalo mecânico distinto seja sentido, confirmando o engato total das características de travamento.
      NOTA: O cartucho foi projetado com uma única orientação correta; Montagem incorreta não vai produzir o estalido. Segure os substratos pelas bordas o tempo todo para evitar contaminação ou danos às superfícies funcionais e evite que os substratos deslizem uns contra os outros, pois isso pode riscar os revestimentos superficiais.
   2. Ponto de verificação: Confirme a montagem correta com o encaixe mecânico.
      NOTA: Não há um indicador elétrico pré-corrido da integridade do revestimento; quaisquer falhas funcionais resultantes de montagem inadequada são detectadas automaticamente e reportadas no relatório de controle de qualidade pós-execução.
      Ponto de pausa: Armazene cartuchos montados não utilizados em um pacote selado com dessecante (pacotes de gel de sílica) em temperatura ambiente por até 48 horas.

3. Preparação da célula

1. Prepare 1 mL de tampão de transfecção completo fresco antes de cada uso, combinando tampão de eletroporação compatível com DMF com o surfactante biocompatível não iônico fornecido em uma proporção de 20:1 (v/v) (tampão de eletroporação: surfactante), obtendo uma concentração final de surfactante de 0,05% (v/v). Misture delicadamente e mantenha no gelo.
   NOTA: O buffer de transfecção compatível com DMF usado aqui é um buffer isotônico de baixa condutividade (condutividade: 3,5 mS/cm, osmolalidade: 305 mOsm/L). Pesquisadores que utilizam buffers alternativos devem verificar a compatibilidade com a atuação do DMF e a viabilidade da célula. O surfactante biocompatível não iônico serve para reduzir a fixação de gotículas; se o surfactante fornecido não for utilizado, um substituto adequado.
2. Lave as células T ativadas uma vez com Tampão de Transfecção (que não contém surfactante). Centrifugar a 180 × g por 5 min, aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em Buffer de Transfecção Completa (contendo surfactante) a 1,0 × 10⁷ células/mL em um volume total de 100 μL por cartucho. Fique no gelo.
3. Imediatamente antes de carregar no cartucho, adicione nuclease Cas9 diretamente aos 100 μL da suspensão de células T e misture pipeteando suavemente; Fique no gelo.
   NOTA: Para células T primárias, o Cas9 é carregado a 42 pmol por volume de cartucho de 100 μL (0,42 pmol/μL). Cada sítio de eletroporação processa aproximadamente 1 μL de suspensão celular, entregando 0,42 pmol Cas9 por edição. Otimize essa dose ao se adaptar a outros tipos de células imunes (veja a Tabela 1).

Componente	Concentração final por edição
Cas9	0,42 pmol em uma gota de ~1 μL
sgRNA	2,1 PMOL (de 40 nL Spot)
PGA	44,4 mg/mL de estoque na mistura para manchas
Tensioativo	0,05% (v/v)
Entrada de célula	~10.000 células

Tabela 1: Tabela resumida das concentrações finais em cada gotícula de transfecção.

4. Transfecção na plataforma de DMF-ecção

1. Usando uma pipeta multicanal, dispense 10 μL da mistura T-célula/Cas9 em cada uma das 8 portas de carga das células, e 10 μL de tampão de transfecção completo nas 16 portas de carga de eletrodos líquidos (conforme mostrado na Figura 1).
2. Ajuste a voltagem para 500 V, duração do pulso para 3 ms e número de pulsos para 2. Inicie a sequência de eletroporação conforme as instruções da plataforma.
   1. Checkpoint: Revise o relatório de controle de qualidade pós-corrida imediatamente após a corrida. Falhas esporádicas (<10% dos sites) não requerem intervenção. Se as falhas forem sistemáticas, substitua o cartucho pela placa de controle de qualidade fornecida, execute a Verificação de Saúde do Sistema (~2 min) e entre em contato com o suporte técnico caso os problemas persistam.

5. Descarregamento e recuperação de células T editadas

1. Usando um manipulador de líquidos, transfira células eletroporadas de cada local de reação para uma placa U-bottom de 96 poços contendo 150 μL de meio basal de células T pré-aquecidas, suplementado com 200 IU/mL de IL-2.
2. Incubar células por 72 horas a 37 °C, 5% de CO₂ para permitir a renovação proteica e mudanças na expressão dos receptores na superfície.

6. Análise de citometria de fluxo do TRAC knockout

1. Transfira as células para uma placa inferior cônica estéril de 96 poços para reduzir a perda celular entre as lavagens. Lave as células duas vezes com o Flow Cytometry Buffer (1× PBS, 2% FBS, 2 mM EDTA) centrifugando a 400 × g por 5 minutos e removendo o sobrenadante invertendo suavemente a placa cônica inferior. As células permanecerão em pellets na placa.
2. Prepare uma mistura mestre de coloração superficial contendo anticorpos anti-CD4, anti-CD8 e anti-TCRα/β em Buffer de Citometria de Fluxo nas concentrações recomendadas pelo fabricante. Adicione 25 μL da mistura master por poço e incube por 20 minutos a 4 °C protegido da luz. Lave duas vezes com 1× PBS (sem FBS) centrifugando a 400 × g por 5 minutos. Resuspenda as células em 100 μL de 1× PBS contendo um corante de viabilidade em 1:1.000 (v/v) e incube por 10 minutos em temperatura ambiente, protegida da luz.
   NOTA: Placas cônicas inferiores são eficazes para pelletar células; Verifique se as células estão bem ressuspensas em todas as etapas.
3. Lave as células duas vezes com o Tampão de Citometria de Fluxo e ressuspenda em 150–200 μL por amostra para aquisição.
4. Configure o citômetro com linhas de laser e conjuntos de filtros apropriados para os fluorocromos usados (por exemplo, excitação de 488 nm para corante de viabilidade; 405 nm ou 488 nm para marcadores de superfície, conforme apropriado). Ajuste as tensões usando controles de compensação de uma única coloração e uma amostra não corada. Colete no mínimo 5.000 eventos de singlets ao vivo por amostra. Gate sequencial em: singletes de dispersão → células vivas (corante de viabilidade negativo) → CD4⁺ ou CD8⁺ → expressão TCRα/β.
   NOTA: Sob condições padrão, o total de eventos ao vivo adquiridos pode variar de 5.000 a mais de 10.000 por amostra após perdas durante lavagem e coloração, dado que as células tiveram tempo para proliferar.
5. Determine a perturbação do gene TRAC medindo a frequência das células TCRα/β-negativas nas populações CD4⁺ e CD8⁺. Reporte a eficiência de knockout como a porcentagem de células TCRα/β-negativas em relação à porta singlete viva para cada subconjunto.

Resultados

Desfechos esperados
A eletroporação de 10.000 células T ativadas por condição normalmente resulta em >85% de eficiência de eliminação TRAC com viabilidade de >95% 72 horas após a transfecção. A citometria de fluxo revela uma clara perda de coloração TCRα/β na condição de direcionamento TRAC em relação aos controles de sgRNA (NTC) não direcionados e aos controles não expostos a campos elétricos. Salvo indicação em contrário, n representa execuções independente...

Discussão

Esse protocolo descreve um fluxo de trabalho miniaturizado de eletroporação microfluídica digital que permite a entrega intracelular eficiente em células T humanas primárias usando gotículas em escala de nanolitros. Uma vantagem central desse método é a capacidade de realizar a edição do genoma CRISPR–Cas9 usando apenas 10.000 células por reação, reduzindo drasticamente os requisitos de material em comparação com a eletroporação convencional. A arquitetura baseada em gotículas suporta au...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	Instrumentação
1x PBS	Gibco		Flow Buffer
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	Protocolo de esferoide
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	Protocolo de esferoide
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 em 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		Instrumentação
DMEM Media	Gibco	10564011	Suplemento de mídia- cultura de esferoide
DMF compatible buffer	DropGenie		Transfecção
DropGenie Transfection System	DropGenie		Instrumentação
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		Flow Buffer
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Fluorescent Microscope	ThermoFisher		Instrumentação
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Suplemento de mídia- cultura de esferoide
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector	Fida Biosystems ApS		Instrumentação
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Cells	ATCC		Protocolo de esferoide
Human IL-2 Recombinant Protein,	Peprotech	200-02 50ug	Suplemento de mídia de célula T
Human Primary Pan CD3+ T Cells	All Cells		Sangue Periférico, Crioconservado, Células T Helper pan CD3+, Selecionadas Negativamente
Immunocult CD3/CD28 Activator	StemCell Technologies	10970	Mídia de ativação de célula T
Immunocult Expansion Media	StemCell Technologies	10981	Mídia de ativação de célula T
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		Instrumentação
INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot	Integra	4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),	Instrumentação
non targeting synthetic guide RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody	Biolegend	380805	1 em 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 em 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Suplemento de mídia- cultura de esferoide
Poly-L-glutamic Acid (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	Use a a 100mg/ml
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		Software
sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease	IDT	10017687
Spheroid Microplate	Corning	3830	Protocolo de esferoide
Surfactant F	DropGenie		Transfecção- use a 1:20 em buffer compatível com DMF para fazer buffer de transfecção completo
TRAC synthetic guide RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25-300-062	Protocolo de esferoide