Um algoritmo de análise de forma quantifica a morfologia espacial e o contexto da cultura celular 2D a 3D para uma nova quantificação de fenótipos

Resumo

Este artigo explica como novas características morfológicas em células e organoides podem ser quantificadas usando a transformada linear de coordenadas polares comprimidas (LCPC), um algoritmo espacial que captura propriedades que métricas tradicionais, como área, volume e área superficial, não conseguem. As melhores práticas para orientação e alinhamento da forma são discutidas.

Resumo

Numerosos estudos mostraram que o fenótipo morfológico de uma célula ou organoide está correlacionado com sua suscetibilidade a agentes anticâncer. No entanto, métodos tradicionais de medição do fenótipo dependem de métricas espaciais como área, volume, perímetro e intensidade do sinal, que funcionam, mas são limitadas. Essas abordagens não conseguem medir muitas características cruciais do contexto espacial, como a quiralidade, uma propriedade da esquerda e da destreza. O volume não pode ser usado para registrar quiralidade porque os sapatos esquerdo e direito têm o mesmo volume. Embora o contexto espacial na forma de quiralidade, direção da gravidade e eixo de polaridade seja intuitivo para os humanos, as métricas tradicionais usadas por biólogos celulares, patologistas, radiologistas e praticantes de aprendizado de máquina até hoje não conseguem capturar essas noções fundamentais. A transformada linearizada de coordenadas polares comprimidas (LCPC) é um algoritmo inovador que pode capturar contexto espacial como qualquer outra métrica. A transformada LCPC traduz um contorno bidimensional (2D) em uma onda senoidal discreta ao sobrepor um sistema de grade que acompanha os pontos de interseção entre o contorno e as linhas da grade. Ele transforma o contorno em uma sequência de pares de coordenadas discretas, sendo a coordenada independente (coordenada x) correspondendo a posições consecutivas no espaço 2D. Cada coordenada dependente (coordenada y) consiste na distância entre uma interseção do contorno e da grade até a origem ou linha de base do sistema de grade. Na forma de uma onda senoidal discreta, a Transformada Rápida de Fourier é então aplicada aos dados. Dessa forma, as formas das células em cultura celular 2D e 3D são representadas de forma sistemática e multidimensional, permitindo uma estratificação quantitativa robusta que revelará insights sobre a resistência ao tratamento.

Introdução

A cultura organoide tridimensional (3D) mostrou-se superior à cultura celular bidimensional (2D) na imitação da biologia in ^{vivo 1,2}. Os organoides tornaram-se indispensáveis na pesquisa do câncer para rastreamento de tratamentos eficazes e para obter insights sobre a progressão da ^doença 3,4,5,6. Embora seja bem conhecido na biologia do câncer que distinções morfológicas se correlacionam com comportamentos biológicos distintos de células e tecidos, o campo depende de métricas tradicionais de forma que são limitadas em escopo. Este estudo descreve um algoritmo espacial inovador que quantifica objetivamente características morfológicas sutis com precisão sem precedentes, superando abordagens tradicionais como área, volume e área superficial.

A transformada linearizada das coordenadas polares comprimidas (LCPC) foi inventada para descrever objetivamente e quantitativamente morfologias complexas observadas em histopatologia tecidual, com o objetivo de aprimorar a graduação dos pólipos^{do cólon 7}. O desejo de expandir essa abordagem para capturar características espaciais baseadas em ressonância magnética macroscópica em patologias cerebrais, como transtorno bipolar e doença de Alzheimer, levou a aumentos que a aprimoraram ainda mais. Este estudo descreve o protocolo passo a passo e as melhores práticas para aplicar duas versões da transformada LCPC: o sistema de grade paralela e o sistema de grade radial, ambos com scripts de código aberto e vídeos tutoriais.

Além dos métodos geométricos tradicionais, existem múltiplas abstrações que têm sido eficazes para medir as formas complexas de células e órgãos. Estes incluem medir excentricidade, assimetria, contraste e curtose, juntamente com momentos de Zernike para capturar circularidade, assimetria, irregularidade de arestas e estrutura global^{de contornos 8,9,10}. A análise fractal também tem sido útil para reduzir contornos complexos a valores escalares, como Dimensão Fratal, que mede quão irregular é o contorno, e lacunaridade, que mede quão heterogeneamente irregulares aparecem as lacunas no^{contorno 11,12}. Para medir textura, o método Gray Level Co-occurrence Matrix (GLCM) é popular para medir contraste, energia, homogeneidade, correlação e^{entropia 13,14}. Embora todos esses métodos sejam benéficos, nenhum deles foi projetado para capturar contexto espacial, como a direção da gravidade, a esquerda versus a direita, ou a localização da estrutura central de suporte que influencia a direção da mudança de forma. Além disso, muitos deles produzem um único valor escalar ou apenas alguns poucos valores escalares para representar informações espaciais, razão pela qual os estudos citados frequentemente os usam em combinação para avaliar formas complexas.

A transformada LCPC foi projetada para produzir muitas características a partir de uma única medição e permitir a adição de marcadores espaciais que codificam o contexto espacial na forma, como a direção da gravidade. O método mais próximo da transformada^{LCPC 7} foi publicado um ano depois de¹⁵, compartilhando a mesma ideia central como ponto de partida: aplicar a transformada de Fourier aos contornos das células para medir a forma de um espectro de frequência. No entanto, a transformada LCPC foi desenvolvida de forma independente para ser aplicada por sistemas de grade distintos que deveriam ser usados em conjunto com o conhecimento do contexto espacial fora da forma a ser medida. Além disso, o inventor da transformada LCPC explica neste manuscrito que o espectro de frequências resultante contém vastas quantidades de informações espaciais ocultas. O Arquivo Suplementar 1 contém uma discussão extensa sobre contextos espaciais em biologia que muitas vezes são negligenciados ao usar os métodos citados e como a transformada LCPC pode ser aplicada para capturar esse contexto. Para leitores cujos dados de forma não mostram diferença entre grupos controle e experimental, se seus olhos conseguem ver diferença nas formas, ou cujos dados de forma mostram pouca diferença, mesmo suspeitando que deveria haver uma diferença maior, eles devem tentar a transformada LCPC.

A transformada LCPC oferece um nível de precisão sem precedentes na medição de informações espaciais porque representa formas em múltiplas dimensões. Ao contrário dos métodos tradicionais, como área e volume, que produzem apenas um valor escalar por forma (ou seja, 25^{cm 2}), os resultados da transformada LCPC podem gerar múltiplos índices, cada um correlacionando-se com um aspecto morfológico diferente de uma forma (ou seja, arredondamento vs. nitidez dos cantos, suavidade vs. serrilhamento das arestas). A transformada LCPC descreve uma forma 2D sobreposta a uma grade de linhas retas que se cruzam com seu contorno. Cada sistema de grade possui uma origem (Figura 1) ou uma linha de base (Figura 2) a partir da qual medir distâncias lineares. Consulte as Figuras 1B e 2B para fluxogramas simplificados que descrevem o algoritmo. Cada ponto de interseção entre as linhas da grade e o contorno da forma é detectado. A distância de cada interseção é então calculada em relação a uma linha de base ou origem. Dessa forma, a transformação LCPC converte formas 2D em uma série de pares consecutivos de coordenadas x-y. A coordenada x representa a posição da grade de zero ao infinito, enquanto a coordenada y representa a distância da interseção até a linha base ou origem. Nessa forma, que é uma onda senoide discreta, a transformada rápida de Fourier (FFT) é então aplicada para converter os dados do "domínio da posição" para o domínio da frequência. Se a coordenada x representasse o tempo, então o "domínio da posição" seria equivalente ao "domínio do tempo" nas aplicações padrão da FFT.

Enquanto o sistema de grade radial mede a distância de cada interseção da origem da grade radial (Figura 1A), o sistema de grade paralela sempre mede a distância das interseções com referência a uma linha imaginária à esquerda da forma (Figura 2A). O script de código aberto determina a posição dessa linha imaginária encontrando o pixel mais à esquerda do contorno e então movendo 10 pixels para a esquerda dessa posição. Aqui, a coordenada x dessa posição torna-se a linha de referência a partir da qual todas as interseções são calculadas. Essa regra dos 10 pixels é arbitrária, mas é por isso que todos os contornos analisados pelo script open-source para o sistema de grade paralela devem ter pelo menos 15 pixels de espaço em branco em todos os quatro lados.

Para formas 2D com dobras ou múltiplas camadas, as linhas de grade podem intersectar o contorno mais de uma vez. Nesse caso, as distâncias de todas as interseções ao longo de uma grade são somadas a um único valor. Assim, cada grade tem apenas uma coordenada x e uma coordenada y. Essa soma é representada pelo termo "comprimido" no nome transformada LCPC. A renderização de uma forma 2D não linear em uma onda senoidal discreta é representada pelo termo "linearizada" no nome do algoritmo. Por fim, o termo "coordenadas polares" está no nome do algoritmo porque o primeiro sistema de grade concebido foi uma grade radial de 180 graus de coordenadas^{polares 7}. Mesmo após perceber que as coordenadas polar e cartesiana são intercambiáveis, o nome do algoritmo foi mantido como está. A seção de agradecimentos descreve as razões pessoais que motivaram a invenção e ampliação da transformação LCPC.

O Protocolo 1 era a sequência para obter os dados mostrados na Figura 3B, enquanto o Protocolo 2 era a sequência para obter os dados mostrados na Figura 3C–D. As etapas desses protocolos são implementadas em scripts Python individuais disponíveis no repositório do GitHub "Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform"¹⁶. O Protocolo 1 é um exemplo das etapas de pré-processamento para derivar a "forma pura" em preparação para a transformada LCPC. O Protocolo 2 é um exemplo de etapas de pré-processamento para medir formas "em escala", ou seja, em suas escalas originais em relação umas às outras.

A segmentação pode ser feita manualmente em softwares de processamento de imagem, como o Preview do Mac ou o Paint da Microsoft, ou usando métodos baseados em limiar. Se feito manualmente, uma das quatro cores seguintes deve ser escolhida: azul, verde, rosa/magenta ou vermelho. O repositório do GitHub chamado "Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform"¹⁶ contém uma pasta chamada "script de extração de cor". Esta pasta contém quatro arquivos Jupyter Notebook com código Python que extraem as quatro cores mencionadas e as convertem em máscaras azuis sobre um fundo branco. Esse processo também pode ser realizado aplicando um limiar da cor do contorno em um software de processamento de imagem como o Fiji/ImageJ. Para imagens que contêm contornos com bordas tocando ou bordas sobrepostas (por exemplo, um Diagrama de Venn), elas precisarão ser separadas usando software de processamento de imagem, tornando-se objetos independentes na imagem composta de máscara contendo múltiplos contornos organoides. Isso não se aplica a imagens que contêm apenas um organoide ou múltiplos organoides que não se tocam.

Protocolo

As células humanas primárias usadas neste estudo foram obtidas e cultivadas sob aprovações éticas e procedimentos de consentimento informado previamente^{relatados 17}. As imagens apresentadas aqui foram geradas a partir dessas culturas celulares aprovadas e são publicadas pela primeira vez. Amostras de tecido foram coletadas no Brigham and Women's Hospital e na Universidade da Califórnia, San Francisco, sob protocolos aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB), de pacientes que forneceram consentimento informado para o uso de seus tecidos em pesquisa, conforme descrito^{anteriormente 17}. Nenhuma coleta adicional de espécimes humanos foi realizada para este estudo.

1. Extração da forma pura dos contornos organoides 2D para a transformada LCPC

1. Segmente a borda externa de cada organoide usando qualquer software de processamento de imagem, como o Paint da Microsoft, o Preview do MacOS ou o Fiji/ImageJ.
2. Extraia os contornos dos organoides como máscaras abertas que são linhas azuis sobre fundo branco.
3. Isole cada contorno azul em sua própria tela branca.
   NOTA: Esta etapa só é necessária se uma imagem contiver mais de um contorno.
4. Recorte cada contorno para ter uma margem de um pixel em todos os quatro lados do objeto azul.
5. Adicione 100 pixels de espaço em branco em todos os quatro lados para criar novas margens.
6. Gire os objetos de modo que o maior comprimento interno fique horizontal.
   NOTA: Este passo transforma a linha interna mais longa dentro de cada objeto na largura do objeto. Existem dois roteiros disponíveis para esse propósito. Para formas fechadas, use o Jupyter Notebook chamado "Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length_v2.ipynb". Para formas abertas ou formas com múltiplos componentes, use o Jupyter Notebook chamado "Rotate Green Line_v3.ipynb". A ferramenta Rotate Green Line tem um tutorial em vídeo que está vinculado ao arquivo ReadMe, contido na mesma pasta do arquivo .ipynb.
7. Recorte cada imagem para ter uma margem de um pixel em todos os quatro lados do objeto azul.
   NOTA: Isso é o mesmo que o Passo 1.4. O objetivo do corte desta vez, no entanto, é que a etapa de redimensionamento que vem a seguir redimensiona toda a tela, não apenas o objeto azul nela. Assim, ao tornar o objeto azul quase com a mesma largura e altura da própria tela, redimensionar a tela para 400 pixels de largura também redimensiona o objeto para quase 400 pixels de largura. Existe um Jupyter Notebook chamado "Trim margin to 1-pixel border.ipynb".
8. Redimensione a largura da tela de cada imagem para 400 pixels, ao mesmo tempo em que restringe a proporção de aspecto.
   NOTA: Esta etapa faz com que cada objeto tenha a mesma largura. Restringir a proporção de aspecto impede que o objeto seja distorcido durante o redimensionamento. Existe um Jupyter Notebook chamado "Redimensione a largura para 400 pixels, mas restringa a proporção de aspecto.ipynb".
9. Adicione 100 pixels de espaço em branco em todos os quatro lados para criar novas margens.
10. Gire cada imagem 90 graus no sentido horário ou anti-horário para tornar o maior comprimento interno vertical, sendo consistente com a escolha para todas as imagens.
    NOTA: Na sequência acima, a forma pura é obtida implementando sequencialmente os Passos 1.6, 1.7, 1.8 e 1.9. Adicionar espaço de margem no Passo 1.9 é necessário para evitar erros nos scripts de transformação LCPC que serão feitos em seguida, mas não envolve extração da forma pura. Usuários que desejam medir formas "em escala" não precisam realizar as etapas 1.6, 1.7 e 1.8 na sequência acima, embora ainda devam pré-processar suas imagens de máscara para alcançar a orientação ideal antes de aplicar a transformada LCPC.
11. Realize a transformada LCPC em cada curva de contorno. Use scripts em Python fornecidos para o método¹⁸ da grade radial ou para o método¹⁹ da grade paralela.

2. Extração de forma em escala de contornos organoides 2D para a transformada LCPC

NOTA: O método passo a passo para extrair a forma em escala de objetos é semelhante ao de extração da forma pura no Protocolo 1 acima. Os passos são nomeados idênticos em ambos os protocolos para facilitar o emparelhamento. Por favor, consulte as notas no Protocolo 1 para cada etapa. A principal diferença entre forma pura e forma em escala é que a forma em escala não requer os passos 1.6, 1.7 e 1.8, que são os passos de redimensionamento.

1. Segmente a borda externa de cada organoide. Use uma abordagem computacional ou faça isso manualmente por meio de um software básico de edição de imagens, como o Paint da Microsoft, o Preview do MacOS ou o Fiji/ImageJ.
2. Extraia os contornos dos organoides como máscaras abertas que são linhas azuis sobre uma tela branca. Use Fiji/ImageJ para extrair máscaras ou o script Python^{fornecido 16}.
3. Isole cada contorno azul em sua própria tela branca. Use Fiji/ImageJ para extrair máscaras ou o script Python^{fornecido 16}.
4. Recorte cada contorno para ter uma margem de um pixel em todos os quatro lados do objeto azul. Use Fiji/ImageJ ou o script Python^{fornecido 16}.
5. Adicione 100 pixels de espaço em branco em todos os quatro lados para criar novas margens. Use Fiji/ImageJ ou o script Python^{fornecido 16}.
6. Gire cada contorno de modo que sua linha interna mais longa fique vertical. Use Fiji/ImageJ ou o script Python^{fornecido 16}.
7. Realize a transformada LCPC em cada curva de contorno. Use scripts em Python fornecidos para o método¹⁸ da grade radial ou para o método¹⁹ da grade paralela.

Resultados

A transformada LCPC de grade radial aplicada a organoides de câncer de mama

Organoides e tumores 3D podem adotar uma variedade de formatos, alguns dos quais são obviamente diferentes para o olho humano, mesmo que métricas tradicionais apresentem diferenças estatisticamente insignificantes. Por outro lado, organoides também podem exibir formas que parecem heterogêneas e, portanto, insignificantes ao olho humano, mascarando morfologias sutis rec...

Discussão

Como em qualquer ferramenta computacional, a qualidade da saída depende se as entradas seguem as regras esperadas em torno das quais a ferramenta foi projetada. As seguintes regras devem ser seguidas e usadas como verificação de controle de qualidade ao utilizar os scripts Python fornecidos. Primeiro, certifique-se de que as máscaras abertas sejam linhas azuis sobre fundo branco. Azul foi uma decisão arbitrária e não tem significado, mas os scripts que realizam a transformação LCPC foram...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Add 100 pixels to margins.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Average K-means Nearest Neighbor via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.neighbors.NearestNeighbors.html	Used the NearestNeighbors function within the sklearn.neighbors package
BLUE_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Chamfer Distance via scipy version 1.15.1	SciPy	https://docs.scipy.org/doc/scipy/reference/generated/scipy.spatial.cKDTree.html	Used cKDTree function within scipy.spatial package
Cliff's Delta	Tissue Spatial Geometrics Lab	https://github.com/dh2nguyen/Cliffs-Delta	Created an implementation of Cliff's Delta via the Python language
Enlarge Image Size by 3X.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Fiji/ImageJ v2.14.0	ImageJ.net	https://imagej.net/
Flip images HORIZontally.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Flip images VERTically.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
GREEN_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Isolate Objects Empty Blue.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
MacOS Preview Version 11.0	Apple Inc	https://support.apple.com/guide/preview/welcome/mac
Master Script_Parallel Grid LCPC_DN_071025.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Radial-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Master Script_Radial Grid LCPC_bBoxCentered.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Parallel-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Microsoft Paint	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/windows/tips/paint	Was mentinoed as a potential useful tool for manual segmentation, but not used in this study
Microsoft Powerpoint Version 16.109.3	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/powerpoint/cfq7ttc0pbmc
PINK_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Principal Component Analysis (PCA) via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/api/sklearn.decomposition.html	Used the PCA function with the sklearn.decomposition package
RED_Color Extraction (Mac).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
RED_Color Extraction (Windows).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate Green Line_v3.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CCW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Thicken Blue Lines.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Trim margin to 1-pixel border.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook