Triagem de alto rendimento de mutantes Bacillus coagulans , hiperprodutora de ácido l-lático, utilizando uma plataforma microfluídica automatizada de gotículas

Resumo

Esse protocolo apresenta um fluxo padrão de triagem de alta produtividade para microrganismos industriais. Envolve construir uma biblioteca mutante via mutagênese ARTP, realizar triagem positiva de gotículas com microfluídica automatizada e, posteriormente, verificar os resultados. A confiabilidade do fluxo de trabalho foi validada por meio de triagem de cepas de B. coagulans de alto rendimento.

Resumo

A biomanufatura industrial depende de microrganismos para sintetizar eficientemente produtos-alvo sob condições de engenharia. No entanto, cepas do tipo selvagem frequentemente não têm capacidade para isso devido às suas redes metabólicas nativas. Portanto, a triagem rápida e precisa de cepas de alto desempenho em bibliotecas mutantes em grande escala é um passo crítico no melhoramento microbiano industrial. Nos últimos anos, a tecnologia microfluídica de gotículas atraiu atenção significativa por sua alta produtividade, baixo consumo e capacidade de compartimentalização de célula única, levando ao desenvolvimento de inúmeros sistemas de separação de célula única. Um protocolo de triagem de alto rendimento para cepas microbianas industriais utilizando uma plataforma microfluídica automatizada de gotículas é apresentado neste estudo. O fluxo de trabalho integrado compreende quatro estágios-chave: construção de uma biblioteca mutante por meio de mutagênese de plasma atmosférico e à temperatura ambiente (ARTP); encapsulamento de célula única de alta eficiência e microcultivo controlado dentro de gotículas em escala de picolitro; pico-injeção precisa de um biossensor fluorescente, seguida por filtragem de gotículas ativada por fluorescência (FADS) para isolar gotículas contendo variantes de alta produção; e validação das cepas candidatas selecionadas por meio de fermentação em microplacas e balões agitados. Um fluxo de trabalho completo e integrado de triagem é concebido como um modelo padronizado, e sua validação é demonstrada pelo isolamento de mutantes produtores de ácido L-lático de alto rendimento de B. coagulans como exemplo específico. Esta plataforma automatizada e de alta capacidade oferece uma solução técnica poderosa com potencial significativo para acelerar o melhoramento industrial de cepas de alto desempenho.

Introdução

A biotecnologia industrial utiliza microrganismos e enzimas como biocatalisadores para produzir produtos valiosos em larga escala. Essa abordagem é considerada mais ambientalmente correta e eficiente do que a fabricação tradicional de produtos químicos. No entanto, as redes metabólicas naturais dos microrganismos evoluíram para priorizar sua própria sobrevivência e reprodução, em vez da síntese eficiente dos produtos desejados pelos humanos. Como resultado, o melhoramento microbiano de alto rendimento é frequentemente necessário para atender às demandas dos ambientes industriais de produção com condições ^{rigorosas 1,2,3}. Esse processo envolve a construção rápida de bibliotecas de mutantes microbianos em grande escala por meio de mutagênese física ou química, seguida pelo cultivo e detecção fenotípica de mutantes com genótipos distintos. Apenas uma pequena fração das cepas superiores é então selecionada. No entanto, as tecnologias tradicionais de triagem baseadas em placas e microplacas são prejudicadas por procedimentos incômodas, baixo rendimento e alto custo. Esse gargalo, junto com o consumo significativo de consumíveis e reagentes, resulta em baixa eficiência geral do melhoramento^{microbiano 4,5}.

A microfluídica de gotículas emergiu recentemente como uma solução transformadora para esse desafio. Em contraste com a separação celular ativada por fluorescência (FACS), que é pouco adequada para a triagem de produtos secretados devido à rápida difusão das moléculas para longe da célula, a separação de gotículas ativada por fluorescência (FADS) encapsula células individuais em microreatores compartimentados em^{escala de picolitro 6,7,8}. Esse isolamento físico impede a competição de cepas, possibilita o acúmulo localizado de metabólitos secretados e possibilita sua detecção quantitativa por meio de biossensores fluorescentes. Consequentemente, o FADS provou ser uma plataforma ideal para triagem de alto rendimento de diversos produtos extracelulares, incluindo aminoácidos, ácidos orgânicos e enzimas. Uma equipe desenvolveu o biossensor fluorescente geneticamente codificado GECFINDER e, combinado com o FADS, fez triagem com sucesso de cepas produtoras de fenilalanina alta e melhorou a eficiência da triagem em mais de 1000 vezes⁹. Outro grupo estabeleceu uma plataforma de triagem de gotículas ativada por fluorescência, acoplada a um biossensor geneticamente codificado para triagem de alta capacidade de cepas produtoras de ácido 3-desidroshimímico em E. coli, e o sistema FADS otimizado melhorou significativamente a eficiência da triagem e permitiu o isolamento de cepas mutantes com produção significativamente^{aprimorada 10}. Alguns pesquisadores aplicaram a tecnologia FADS à engenharia da polimerase de DNA Bst, e os mutantes adquiridos com termostabilidade e atividade de deslocamento da fita muito aprimorados foram ainda aplicados à detecção de LAMP, o que reduziu o tempo de reação de 40 min para 10 min¹¹.

No entanto, a tradução desses avanços tecnológicos em fluxos de trabalho rotineiros de desenvolvimento de decepção industrial continua sendo desafiadora. Muitos sistemas microfluídicos comerciais de gotículas, apesar de seu hardware sofisticado, carecem de um procedimento operacional padrão completo, intuitivo e reproduzível, voltado para triagem fenotípica microbiana. Para suprir essa lacuna, foi adotada uma plataforma microfluídica automatizada de gotículas, integrando controle fluido modular, software amigável e design padronizado de chips, estabelecendo uma base técnica ideal para o estabelecimento de um fluxo de trabalho de triagem totalmente integrado. Este estudo utiliza a triagem de alto rendimento de B. coagulans produtores de ácido L-lático de alto rendimento como caso de validação. Baseado em uma plataforma microfluídica de gotículas, foi estabelecido o seguinte fluxo de trabalho, compreendendo quatro etapas sequenciais chave: (1) construção de uma biblioteca mutante diversificada via mutagênese atmosférica e plasma à temperatura ambiente (ARTP); (2) encapsulamento de célula única de alta eficiência e microcultivo controlado dentro de gotículas sob condições otimizadas para o crescimento de B. coagulans e produção de ácido L-lático; (3) pico-injeção precisa de um biossensor fluorescente específico para L-lactato, seguida de triagem rápida de gotículas que encapsulam produtores superiores; e (4) validação rigorosa dos candidatos selecionados por fermentação em frascos agitados para confirmar maior produção e estabilidade genética. Este protocolo é destinado a pesquisadores e engenheiros envolvidos em melhoramento microbiano industrial que exigem triagem de alto rendimento de produtos extracelulares. É particularmente adequado para bactérias cultiváveis que secretam metabólitos ou enzimas de pequenas moléculas. A plataforma de triagem deve ser equipada com sensores compatíveis com o microambiente de gotículas para permitir a detecção específica dos metabólitos-alvo. Para cepas com requisitos especiais de cultivo (por exemplo, anaeróbios estritos), os parâmetros de cultivo podem ser adaptados para otimizar e estabelecer uma estratégia de cultivo dedicada. Ao estabelecer esse fluxo de trabalho de triagem padronizado e em ciclo fechado, este estudo visa fornecer uma solução poderosa e transferível para acelerar o melhoramento industrial de cepas.

Protocolo

Não foi necessária aprovação ética para este estudo. Todos os experimentos foram realizados usando culturas microbianas puras, e nenhum indivíduo humano ou animal de laboratório participou dessa pesquisa. Consulte a Tabela de Materiais para detalhes sobre todos os materiais usados no protocolo a seguir.

1. Preparativos

ATENÇÃO: Siga as práticas de biossegurança. B. coagulans é um organismo de Nível 1 de Biossegurança. Use luvas e jaleco. Realize todas as manipulações abertas dentro de uma capela de fluxo laminar. Autoclave todos os materiais que entram em contato com células vivas a 121 °C por 20 minutos antes do descarte.

1. Fonte de deformação e manutenção
   1. Compre o B. coagulans ATCC 7050 em um centro comercial de coleta de culturas como uma cultura inclinada de segunda geração.
   2. Estrie uma laçada da cultura inclinada sobre o ágar do meio de semente e incube a 50 °C por 24 horas. Escolha uma colônia única, inocule-a em meio líquido para sementes e cresça a 50 °C, 200 rpm por 12 horas.
   3. Misture a cultura resultante com glicerol estéril de 40% até uma concentração final de 25% (v/v) e armazene como estoques congelados a –80 °C. Para cada experimento, descongele uma alíquota fresca, trace-a sobre o ágar do meio de semente e incube a 50 °C por 24 horas.
   4. Em seguida, colhe uma colônia única, inocule-a em meio líquido de sementes e cultive a 50 °C, 200 rpm por 12 horas antes de usar para mutagênese e triagem (Figura Suplementar 1).
2. Sensor de ácido lático
   1. Expresse e purifique o sensor eLACCO1.1 conforme descrito nos Materiais^{Suplementares 12} (Figura Suplementar 2).
   2. Suplemente o sensor purificado com glicerol a 5% (v/v) e armazene-o a –80 °C. Para cada experimento, descongele uma alíquota em gelo e dilua-a imediatamente com PBS estéril de 10 mM (pH 7,4) até uma concentração final de trabalho de 0,1 mg/mL.
3. Preparação dos meios culturais
   1. Meio de semente (g/L: glicose 20, extrato de levedura 5, triptona 10, acetato de sódio 2, citrato de sódio 2, K₂HPO₄ 2, MgSO_{4,7H 2}O 0,2, MnSO₄· H₂O 0,05, FeSO 4,7H₂O 0,01). Esterilize a glicose separadamente como um caldo de 200 g/L a 115 °C por 20 minutos.
      1. Autoclave dos componentes restantes a 121 °C por 15 minutos. Após o resfriamento, adicione o estoque estéril de glicose a uma concentração final de 20 g/L e, em seguida, filtre-esterilize os elementos traço.
      2. Armazene o meio completo a 4 °C por até uma semana. Use para ativação noturna e preparação de inoculos.
   2. Meio de triagem (g/L: glicose 20, extrato de levedura 6,66, NaCl 0,333, NH₄Cl 0,665, KH₂PO₄ 2, Na₂HPO₄ 4,46, MgSO₄ 0,12, CaCl₂ 0,074).
      1. Esterilize a glicose separadamente a 115 °C por 20 minutos. Autoclave a mistura de sal e extrato de levedura a 121 °C por 15 minutos.
      2. Após o resfriamento, adicione o caldo de glicose estéril a 20 g/L. Armazene a 4 °C por até uma semana. Uso como fase aquosa para geração de gotículas e como meio de cultivo dentro das gotículas durante a incubação de 10 horas.
   3. Meio de fermentação (g/L: glicose 90, triptona 13,33, extrato de levedura 13,33, acetato de sódio 0,67, NaCl 0,0133, MgSO_4,7H₂O 0,0133, MnSO₄· H₂O 0,0133, FeSO 4,7H ₂O 0,0133).
      1. Esterilize a glicose como um caldo de 500 g/L a 115 °C por 20 minutos. Autoclave dos outros componentes a 121 °C por 15 minutos.
      2. Após o resfriamento, adicione o estoque de glicose estéril a 90 g/L. Adicione o pó estéril de CaCO₃ (4% em p/v) pouco antes da inoculação para o pH tampon. Prepare fresco diariamente. Use para triagem primária em microplacas e validação de balões agitados.
         NOTA: Prepare todo o meio com água destilada até um volume final de 1 L. Ajuste o pH para 6,5 com 1 M HCl.

2. Construção de uma biblioteca mutante usando ARTP

ATENÇÃO: A operação ARTP envolve um plasma de alta frequência e uma lâmpada UV. A radiação UV pode causar lesões nos olhos e na pele. A descarga do plasma gera ozônio e altas temperaturas. Sempre mantenha a porta da câmara fechada enquanto o plasma estiver ligado. Use jaleco e óculos de proteção contra raios UV. Use apenas 99,999% de hélio puro; Garanta ventilação adequada. Após cada operação de mutagênese, limpe a bancada e as paredes internas da câmara de mutagênese com um pano sem fiapos mergulhado em etanol a 75% (v/v). O etanol de 75% é altamente inflamável. Fique longe de chamas abertas, faíscas e superfícies quentes.

1. Estabeleça uma curva padrão correlacionando OD₆₀₀ com a concentração celular viável.
   1. Inocule uma única colônia de B. coagulans em meio de semente e incube a 50 °C, 200 rpm por 12 horas até que a cultura atinja a fase logarítmica média.
   2. Prepare diluições seriadas da suspensão bacteriana em gradientes de 10⁴, 10⁵ e 10⁶.
   3. Pipete 100 μL de cada diluição e espalhe uniformemente sobre as placas de ágar do meio semente em triplicado.
   4. Incube todas as placas de ágar placadas a 50 °C por 24 horas.
   5. Conte as unidades formadoras de colônia (CFU) para cada diluição.
      NOTA: A calibração mostra que OD₆₀₀ = 0,5 corresponde aproximadamente a 1 × 10⁸ CFU/mL. Use essa relação para determinar a densidade celular inicial para encapsulamento de gotículas (Figura Suplementar 3).
2. Cultive B. coagulans até a fase de médio a final do logarítmico, depois dilua a cultura fresca de sementes para OD₆₀₀ = 0,05 em meio fresco de sementes.
3. Dentro de um exaustor de fluxo laminar, prepare oito pequenos discos metálicos estéreis e um disco grande de metal. Flameje os oito discos pequenos sobre um queimador de álcool por 1 minuto, coloque-os no disco grande estéril e deixe esfriar por 10 minutos.
4. Usando uma micropipeta, espalhe uniformemente 10 μL da suspensão bacteriana diluída em cada um dos oito pequenos discos resfriados.
5. Transfira o disco grande que contém os pequenos discos inoculados para uma placa de Petri estéril.
6. Ligue o instrumento ARTP e ative a tela de controle principal. Ligue a lâmpada UV dentro da câmara de mutagênese. Ligue o resfriador e pré-resfrie por 20 minutos até a temperatura estabilizar em 20 °C.
7. Abra rapidamente a porta da câmara de mutagênese e coloque os pequenos discos dentro.
8. Usando pinças estériles, transfira sequencialmente cada pequeno disco para o palco de amostra ARTP.
   NOTA: A potência RF, a taxa de fluxo de gás hélio, a distância do bico à amostra e a pureza do hélio foram fixadas em 120 W, 10 SLM, 2 mm e 99,999%, respectivamente. O tempo de irradiação de hélio foi ajustado para 5, 10, 15, 20, 25 e 30 s, respectivamente.
9. Submeta cada pequeno disco à mutagênese ARTP de acordo com os parâmetros estabelecidos. Após a irradiação, transfira todos os discos para um tubo centrífugo de 50 mL contendo 10 mL de meio de recuperação. Incube a 50 °C com agitação a 200 rpm por 4 horas para permitir a recuperação e crescimento celular.
10. Determinação da taxa de letalidade.
    1. Diluir serialmente a cultura recuperada para um gradiente de ^10-2 a ^10-6.
    2. Espalhe 100 μL de cada diluição sobre placas de ágar do meio semente e prepare três réplicas para cada diluição.
    3. Incube todas as placas a 50 °C por 24 horas.
    4. Conte as colônias e calcule a CFU/mL correspondente.
    5. Calcule a taxa de letalidade usando a fórmula:
       (1)
       NOTA: Realize o experimento em triplicado para cada ponto de tempo. O tempo ótimo de mutagênese para ARTP neste caso é de 20 s (Figura Suplementar 4).

3. Composição da plataforma microfluídica automatizada de gotículas e consumíveis

1. Sistema de atuação (Figura 1)
   NOTA: Consiste em 3 canais de controladores de pressão de alta precisão com faixa de pressão de 0 a 1000 mbar e tempo de resposta de pressão de < 50 ms (Figura 1A).
2. Sistema de imagem
   NOTA: Imagens microscópicas CMOS de alta velocidade apresentam aquisição de dados de imagem em alta velocidade de ≥ 2 GB/s, taxa de quadros de 0 a 20.000 fps e resolução máxima de 1280 x 860. O sistema conta com foco automático para observação em tempo real do movimento das gotas e suporta gravação de imagens e vídeos, que podem ser exportados em múltiplos formatos, incluindo BMP, AVI, MP4 e TIF.
3. Sistema de detecção
   NOTA: Ele permite a detecção de sinais fluorescentes com 2 lasers: 488 nm e 633 nm, e 2 canais de detecção.
4. Sistema de controle do host
   NOTA: Controlado pelo software automatizado da plataforma microfluídica de gotículas, o sistema integra múltiplos módulos, incluindo atuação de fluidos, imagem microscópica, excitação e detecção, geração de gotas, pico-injeção e triagem. Também suporta a aquisição, gravação, armazenamento, exibição e exportação de dados experimentais. Unidades operacionais parciais da plataforma microfluídica automatizada de gotículas são mostradas (Figura 1B).
5. Consumíveis
   NOTA: Os consumíveis usados neste protocolo incluem: tubo de injeção para fase oleosa, amostra e reagente (Figura 2A); tubo coletor para incubação de gotículas (Figura 2B); chip de geração de gotículas (Figura 2C); chip de pico-injeção de gotículas (Figura 2D); e chip de separação de gotículas (Figura 2E).

4. Geração de gotículas

ATENÇÃO: Limpe a plataforma microfluídica automática de gotículas. Após cada experimento, limpe o palco, o suporte do lasco e quaisquer áreas de derramamento com etanol a 75% usando lenços sem fiapo. Remova o óleo fluorado residual, a suspensão de células ou a solução sensor.

1. Encapsulamento de célula única. Para obter λ = 0,1 em gotículas de 14 pL, dilua a suspensão bacteriana para OD₆₀₀ ≈ 0,04 (OD₆₀₀=0,5 corresponde a 1 × 10⁸ CFU/mL). De acordo com a distribuição de Poisson:
   (2)
   Quando λ = 0,1, 90,5% das gotículas estão vazias, 9,1% contêm uma única célula e 0,4% contêm múltiplas células.
   NOTA: Neste caso, a eficiência de encapsulamento de célula única medida foi de 11,2% (Figura Suplementar 5). O número de células por gota pode ser determinado por coloração DAPI. Quando λ = 0,1 e a taxa de encapsulamento multicelular excede 1%, o OD₆₀₀ deve ser reduzido para diminuir a proporção de gotículas contendo múltiplas células.
2. Pipete 300 μL de óleo fluorado no frasco de entrada da fase oleosa. Pipete 500 μL da suspensão bacteriana no frasco de entrada da fase aquosa.
3. Descolhe a fita que cobre a superfície do chip de geração de gotas. Conecte o frasco de óleo, o frasco da amostra e o frasco de coleta aos poços correspondentes do chip em sequência.
4. Coloque o chip no palco e prenda-o. Conecte os tubos de ar aos frascos de entrada um por um, conforme os rótulos do caminho do gás.
5. Abra o software automatizado da plataforma microfluídica de gotículas. Ajuste o botão de movimento do estágio de acordo com as direções das setas no chip para mover o campo de visão para o local de geração de gotas.
6. Clique em "Iniciar" na interface "Geração de Gotas" do software automatizado da plataforma microfluídica de gotículas (Figura 3A). Na interface de imagem, arraste os controles deslizantes do "eixo Z" e do brilho da fonte de luz para ajustar a clareza e o brilho da imagem.
7. Clique nos botões "+" e "-" de "Velocidade da Gota" e "Tamanho da Gota" para ajustar a velocidade de geração e o tamanho da gota.
   NOTA: Neste caso, a pressão em fase oleosa e a pressão em fase amostral para geração de gotículas são automaticamente definidas para 300 mbar e 400 mbar, respectivamente, para alcançar uma taxa de geração de 1500 Hz. Sob essas configurações, as gotículas têm 14 pL de volume, mantendo o CV do diâmetro das gotículas abaixo de 5%, garantindo tamanho consistente da gotícula e operações confiáveis a jusante.
8. Espere 1 minuto até que o equipamento se estabilize e o estado de geração de gotículas permaneça consistente. Rapidamente substitua o frasco de coleta para iniciar a coleta de gotas.
   NOTA: Pré-adicione uma pequena quantidade de óleo fluorado ao novo tubo de coleta para cobrir a porta inferior do tubo de Teflon, garantindo que gotículas não entrem diretamente em contato com a parede do tubo e causem fusão.
9. Pare a coleta de gotículas após 30 minutos de operação. Clique em "Parar" na janela pop-up para confirmar a parada da geração de gotículas.
10. Remova suavemente o tubo coletor do chip. Coloque o tubo e o frasco coletor na vertical e espere as gotículas dentro do tubo entrarem no frasco coletivo.
11. Remova o chip, o frasco de entrada da fase oleosa e o frasco de entrada da fase aquosa do palco. Limpe a superfície do palco com álcool 75%. A etapa de geração de gotículas é então concluída.

5. Cultivo de gotículas

1. Adicione 1 mL de óleo mineral ao tubo de coleta.
   NOTA: A camada de óleo mineral cobre a suspensão de gotículas para minimizar a evaporação e reduzir a exposição ao oxigênio, permitindo ainda assim troca gasosa suficiente para o anaeróbio facultativo B. coagulans.
2. Coloque o tubo coletor na vertical em um tubo centrífugo de 15 mL contendo água estéril. Mantenha o tubo de coleta frouxamente fechado e incube a 45 °C por 10 horas.
   NOTA: Após a incubação, certifique-se de que o CV do diâmetro da gotícula seja <10% e que não haja coalescência de gotículas. Descarte lotes se esses critérios não forem atendidos.

6. Pico-injeção de gotículas

ATENÇÃO: Alta tensão é aplicada aos eletrodos do chip por meio da conexão do instrumento durante a pico-injeção. O campo elétrico pode causar um choque elétrico severo. Não toque nos eletrodos ou na superfície do chip com ferramentas de metal ou com as mãos nuas enquanto a alta voltagem estiver ativa. Sempre desative a saída de alta voltagem antes de manusear o chip. Use luvas isolantes e ferramentas não condutivas.

1. Prepare o frasco de entrada da fase óleo. No exaustor de fluxo laminar, pipete 300 μL de óleo fluorado para o frasco de entrada da fase oleosa.
2. Prepare o frasco de entrada da amostra. Remova a tampa do frasco de entrada do tubo de coleta que contém as gotículas. Troque por uma tampa nova.
3. Aparar a ponta do novo frasco de entrada. Corte uma pequena porção da extremidade frontal do novo frasco de entrada para que a ponta fique abaixo do nível líquido das gotículas no frasco da amostra.
4. Aperte a tampa. Prenda a tampa bem firmemente para evitar vazamentos.
5. Prepare o frasco de entrada do reagente. Pipete 500 μL do sensor de ácido lático no frasco de entrada do reagente.
6. Adicione PBS ao frasco de entrada do reagente. Simultaneamente, adicione 500 μL de buffer PBS estéril ao mesmo frasco de entrada do reagente.
   NOTA: Um tampão PBS é adicionado neste experimento para equilibrar o pH das gotículas. A concentração final de trabalho do sensor de lactato foi de 0,1 mg/mL, e o volume de carga do sensor de lactato foi de 500 μL.
7. Use uma lâmina para cortar a fita que cobre os poços de eletrodos e expor os eletrodos. Coloque o multímetro no modo de continuidade e teste a conexão do circuito e o status de curto-circuito do chip.
   NOTA: Se o multímetro mostrar uma conexão normal de circuito dos eletrodos do chip, prossiga para a próxima etapa. Se o circuito estiver aberto, substitua o chip de injeção e teste novamente.
8. Após confirmar a conexão normal do circuito com o multímetro, retire a fita na superfície do chip. Conecte o frasco de óleo, o frasco da amostra, o frasco do reagente e o frasco de coleta aos poços correspondentes do chip em sequência.
9. Coloque o chip no palco e prenda-o. Conecte os tubos de ar aos frascos de entrada um por um, conforme os rótulos do caminho do gás.
10. Abra o software automatizado da plataforma microfluídica de gotículas. Ajuste o botão de movimento do palco de acordo com as direções das setas no chip para mover o campo de visão até a área do eletrodo do chip de gota.
11. Clique em "Iniciar" na interface "Droplet Pico-injection" do software automatizado da plataforma microfluídica de gotículas (Figura 3B). Na interface de imagem, arraste os controles deslizantes do "eixo Z" e do brilho da fonte de luz para ajustar a clareza e o brilho da imagem.
    NOTA: Neste ponto, o instrumento ajusta automaticamente a pressão da bomba na fase do óleo para 400 mbar, a pressão da bomba na fase da amostra para 420 mbar e a pressão da bomba na fase de injeção do reagente para 450 mbar.
12. No estágio inicial de operação, um segmento de ar no cateter será liberado no chip, o que é um fenômeno normal que dura vários minutos.
13. Espere as gotículas entrarem no campo de visão. Clique em "Iniciar injeção Pico". Neste ponto, o campo elétrico do equipamento será ativado. Ajuste a velocidade de geração das gotas, espaçamento das gotas e volume de injeção clicando nos botões "+" e "-" de "Velocidade das Gotas", "Espaçamento das Gotas" e "Volume de Injeção".
    NOTA: O campo elétrico está definido para a marcha máxima padrão. Se gotículas se romperem na região do campo elétrico durante o processo de fusão, mude para a marcha média ou baixa. Neste caso, a taxa de injeção de gotículas foi de 200 Hz.
14. Observe no software de exibição de imagem de alta velocidade. Se as gotículas conseguirem injetar de forma estável no sensor de ácido lático em uma proporção 1:1, espere 5 minutos para o equipamento se estabilizar. Rapidamente substitua o frasco de coleta para iniciar a coleta de gotas.
15. Após a injeção estável por 2 horas, clique em "Parar" para encerrar a pico-injeção de gotículas.
16. Remova suavemente o tubo coletor do chip. Coloque o tubo e o frasco coletor na vertical e espere as gotículas dentro do tubo entrarem no frasco coletivo.

7. Separação por gotas

ATENÇÃO: O demulsificante é um irritante e pode causar irritação na pele e nos olhos. Também é prejudicial se inalada ou engolida. Sempre use equipamentos de proteção individual adequados (luvas, jaleco, óculos de proteção). Manuseie o demulsificante em um local bem ventilado ou exaustor. Recolha o desemulsificante de resíduos em um recipiente separado, claramente rotulado. Não jogue na pia.

1. No exaustor de fluxo laminar, pipete 300 μL de óleo fluorado e adicione-o ao frasco de entrada da fase oleosa. Substitua a tampa do frasco de entrada do tubo de coleta contendo gotículas microinjetadas por uma nova tampo.
   NOTA: Antes de realizar experimentos de separação de gotas, retire 5 μL de gotículas e observe-as sob um microscópio de fluorescência. Meça o diâmetro de pelo menos 200 gotículas; prossiga apenas se o CV < 10%.
2. Use uma lâmina para cortar a fita que cobre os poços de eletrodos e expor os eletrodos. Coloque o multímetro no modo de continuidade e teste a conexão do circuito e o status de curto-circuito do chip.
3. Após confirmar a conexão normal do circuito com o multímetro, retire a fita na superfície do chip. Conecte o frasco de óleo, o frasco da amostra e o frasco de coleta de triagem aos poços correspondentes do chip em sequência.
4. Coloque o chip no palco e prenda-o. Conecte os tubos de ar aos frascos de entrada um por um, conforme os rótulos do caminho do gás.
5. Abra o software de imagem de alta velocidade. Ajuste o botão de movimento do palco de acordo com as direções das setas no chip para mover o campo de visão até a área do eletrodo do chip de gota.
6. Clique em "Iniciar" na interface "Classificação de Gotas" do software automatizado da plataforma microfluídica de gotas. Na interface de imagem, arraste os controles deslizantes do "eixo Z" e do brilho da fonte de luz para ajustar a clareza e o brilho da imagem.
   NOTA: Após clicar em "Iniciar", o instrumento ajusta automaticamente a pressão da bomba de óleo para 300 mbar e a pressão da bomba de amostra para 190 mbar, resultando em uma vazão de gotícula de 100 Hz.
7. No estágio inicial de operação, um segmento de ar no cateter será liberado no chip, que dura vários minutos e é um fenômeno normal.
8. Clique para selecionar o "Laser" e escolha o canal de detecção de 488 nm.
   NOTA: O pessoal experimental pode selecionar um laser de 488 nm, um laser de 633 nm ou uma combinação de ambos, dependendo do desenho experimental de detecção. Potência do laser: 20 mW.
9. Clique em "Gravação de Dados". O instrumento começará a adquirir sinais de fluorescência de gotículas (Figura 3C).
   NOTA: Colete sinais de fluorescência de 50.000 a 100.000 gotículas; O instrumento irá automaticamente ordenar os valores do sinal e gerar um histograma de sinal de fluorescência.
10. Com base no histograma gerado do sinal de fluorescência, defina o limiar de ordenação para os 0,1% superiores do total de sinais de fluorescência e colete gotículas com valores de sinal de fluorescência acima desse limite.
    NOTA: Neste caso, o portão de triagem foi configurado para coletar gotículas com intensidade de fluorescência > 2750 (u.a.), que correspondia aos 0,1% superiores das gotículas.
11. Clique em "Gravação de Dados" novamente. O instrumento irá regravar os sinais de fluorescência das gotículas restantes e classificar as gotículas-alvo com base no limiar estabelecido na Seção 7.10.
    NOTA: Os sinais de gotícula restantes também serão automaticamente ordenados e plotados como um histograma de fluorescência.
12. Após selecionar a região de gotícula alvo, ligue o "Interruptor de Separação" e defina o valor "Força de Deflexão". O equipamento começará a separar as gotas.
    NOTA: O instrumento fornece três níveis selecionáveis de intensidade de campo elétrico (Alto, Médio, Baixo). Para gotículas maiores que 30 μm, selecione Alta; para gotículas menores que 25 μm, selecione Média ou Baixa. Isso garante deflexão estável e eficiência ótima de triagem.
13. Após o equipamento estabilizar por 5 minutos, recoloque o frasco coletor para coletar gotículas positivas.
    NOTA: Durante a separação, o instrumento mede continuamente a intensidade de fluorescência de cada gota em tempo real e a compara com o limiar pré-definido. Apenas gotículas com intensidade de fluorescência acima do limiar são desviadas e coletadas no tubo de coleta positivo. Uma gota é considerada positiva se o instrumento exibir um sinal de fluorescência excedendo o limiar de classificação e, simultaneamente, se observar deflexão de gotas na interface de imagem, confirmando que a gota foi direcionada com sucesso para o canal de coleta positiva.
14. Pare de separar gotículas após 4 horas de operação estável. Clique em "Parar" na interface de "Classificação de Gotas".
15. Remova suavemente o tubo coletor do chip. Coloque o tubo e o frasco coletor na vertical para garantir que as gotículas do tubo entrem no frasco coletivo.
16. Após a coleta de gotas ser concluída, clique no gráfico de dispersão para salvar o gráfico de dispersão do experimento, os valores do sinal de fluorescência das gotículas positivas ordenadas e os valores do sinal de fluorescência de todas as gotículas.
17. Remova o chip, o frasco de entrada da fase oleosa, o frasco da amostra e o frasco do reagente do palco. Feche o software.
18. Desemulsificação por gotículas. Adicione 500 μL de 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctanol ao tubo de coleta de gotículas. Espere 5 minutos, depois adicione 500 μL de meio de criveja novo para a recuperação.
    NOTA: Não agite vigorosamente o tubo coletor após adicionar o demulsificante; Misture suavemente. Após a desemulsificação de gotículas, uma interface clara se formará entre as fases aquosa e oleosa.
19. Pegue 20 μL da suspensão bacteriana desemulsificada, dilua-a 10 vezes e espalhe em duas placas de ágar. Incube a 50 °C por 2 dias.
    NOTA: O fator de diluição pode ser ajustado de acordo com o número de gotículas coletadas. Neste caso, aproximadamente 400 colônias individuais foram obtidas das duas placas.

8. Exportação de dados

1. Clique no gráfico do sinal de fluorescência na área em branco da interface de ordenação do software. Selecione para salvar o gráfico de dispersão do sinal de fluorescência de gotículas, o histograma do sinal de fluorescência e a planilha Excel do sinal de fluorescência, que contêm os valores registrados de intensidade de fluorescência do número total de gotículas, bem como os valores de intensidade de fluorescência das gotículas positivas selecionadas.

9. Triagem primária de microplacas

1. Escolha colônias individuais aleatoriamente.
2. Inocule a placa de poço profundo de 24 poços para a cultura de expansão. Selecione cada colônia selecionada e inocule-a em um poço de uma placa de poço profundo de 24 poços, contendo 2 mL de meio de fermentação. Use um anel de inoculação.
3. Sele a placa de poço profundo de 24 poços com uma membrana não respirável.
   NOTA: Não use uma membrana respirável. Causa evaporação do meio de cultura.
4. Incubar a cultura de expansão. Coloque a placa de poço profundo selada de 24 poços em um incubador agitado a 50 °C, 200 rpm por 24 horas.
5. Subcultura para validação da fermentação. Após 24 horas, transfira 200 μL de cultura de cada poço para uma placa fresca de 24 poços profundos contendo 1,8 mL de meio de fermentação (10% v/v inoculum). Adicione CaCO₃ estéril a uma concentração final de 4% (p/v) em cada poço antes da inoculação para amortecer o pH.
6. Inclua controles. Em cada nova placa de poço profundo de 24 poços, preencha três poços selecionados aleatoriamente com a cepa parental ATCC 7050 como controles negativos. Processe-as de forma idêntica às cepas candidatas.
7. Sele a placa de poço profundo de 24 poços com uma membrana não respirável.
8. Incube a placa de poço profundo de 24 poços. Coloque a placa selada em uma incubadora agitadora a 50 °C, 200 rpm por 24 horas.
9. Prepare amostras para detecção de lactato. Centrifuge a placa a 5.842 × g por 10 minutos. Transfira 10 μL do sobrenadante para uma microplaca preta de 96 poços e dilua com 990 μL de água ultrapura. Misture bem.
10. Adicione o sensor de lactato. Adicione 100 μL da amostra diluída a cada poço de uma nova placa preta de 96 poços. Depois, adicione 100 μL do sensor de ácido lático. Misture suavemente.
11. Meça a fluorescência. Incube a placa em temperatura ambiente por 5 minutos (protegida da luz). Meça a fluorescência usando um leitor de microplacas com excitação a 485 nm e emissão a 515 nm.
12. Defina o limite de seleção de acertos. Calcule a fluorescência média dos três poços de controle parentais (pai) e o desvio padrão (SD_parent). Defina o limiar como F_parent + 3 × SD_parent.
13. Identifique os primeiros hits. Uma cepa candidata é considerada um acerto primário se seu sinal de fluorescência ultrapassar o limiar. Registre o número de acessos primários para validação a jusante.

10. Validação secundária de cepas de alto rendimento

ATENÇÃO: A fase móvel contém ácido sulfúrico diluído (5 mM), que é corrosivo. Evite contato com a pele e a inalação. Use equipamentos de proteção individual adequados (luvas, jaleco, óculos de segurança). Prepare e manuseie a fase móvel em uma área bem ventilada ou exaustor de fumo. Recolha todos os resíduos contendo ácido em um recipiente dedicado para descarte adequado. Não jogue na pia.

1. Prepare a cultura de sementes. Trace as tenhas primárias de impacto nas placas de ágar do meio de semente. Incube a 50 °C por 24 horas. Retire uma colônia de cada placa e inocule-a em 30 mL de meio líquido para sementes em um frasco de shake de 250 mL. Incube a 50 °C, 200 rpm por 12 horas.
2. Prepare a fermentação. Prepare o meio de fermentação e adicione pó estéril de CaCO3 a uma concentração final de 4% (p/v) como neutralizador de pH. Transfira 5 mL da cultura de sementes para 45 mL desse meio em um frasco Erlenmeyer de 250 mL (10% de inóculo v/v; volume final de trabalho 50 mL).
   NOTA: Use três frascos independentes para cada cepa candidata e para a cepa parental ATCC 7050 como controle.
3. Incube os frascos. Coloque os frascos em uma incubadora agitada a 50 °C, 200 rpm. Fermente por 24 horas.
4. Colete amostras. Após 24 horas, retire 1 mL de cultura de cada frasco. Centrifuge a 13.800 × g por 2 minutos. Dilua o sobrenadante 100 vezes com água ultrapura e filtre através de um filtro de seringa de 0,22 μm.
5. Configure condições de HPLC. Use uma coluna Aminex HPX-87H. Preparar a fase móvel: 5 mM H₂SO₄ em água ultrapura, filtrar através de membrana de 0,22 μm e desgasificar por sonicação. Ajuste a temperatura da coluna para 40 °C, vazão para 0,6 mL/min, volume de injeção para 20 μL e tempo de funcionamento para 20 min por amostra (ácido lático elude em ~12,600 min). Use um detector de índice de refração (RID).
6. Prepare a curva padrão. Dissolva o L-lactato de cálcio em água ultrapura para preparar soluções padrão de 0, 0,4, 0,8, 1,2 e 1,6 g/L (expresso como L-lactato de cálcio). Injete cada padrão em triplicado.
   NOTA: Plote a área máxima em relação à concentração e obtenha a equação de regressão linear (R² > 0,999). Execute padrões no início e no final de cada lote de amostra para corrigir a deriva.
7. Injete as amostras. Injete os supernadantes filtrados da fermentação (20 μL) no sistema HPLC. Registre a área de pico do pico do L-lactato de cálcio.
   NOTA: Injete uma amostra de controle de qualidade (1 g/L de L-lactato de cálcio) a cada 10 amostras para monitorar a estabilidade do sistema. A variação aceitável do tempo de retenção é de <0,2 min e a variação da área de pico <5% em comparação com o padrão inicial de calibração.
8. Calcule o rendimento do ácido L-lático. Interpole a área de pico de cada amostra na curva padrão para obter a concentração de L-lactato de cálcio (g/L).
   NOTA: Converta para a concentração de ácido L-lático usando a razão de peso molecular:
   (3)
   Calcule a porcentagem de melhoria:
   (4)
9. Identifique as últimas cepas de alto rendimento. Selecione as cepas que apresentam consistentemente maior rendimento de ácido L-lático do que a cepa parental como mutantes validados. Escolha o melhor performer para caracterização mais detalhada.

11. Avaliação genética da estabilidade de cepas de alto rendimento

1. Estrie a cepa mutante selecionada sobre placas de ágar de meio de semente. Incube a 50 °C por 24 horas. Esta é a geração 1.
2. Escolha uma colônia única da placa da geração 1 e inocule-a em 5 mL de meio líquido para sementes em um tubo de 50 mL. Incube a 50 °C, 200 rpm por 12 horas para obter a cultura de sementes F1.
3. Transfira 10% (v/v) da cultura de sementes da geração 1 para 50 mL de meio de fermentação (contendo 4% de CaCO₃ estéril em w/v) em um frasco de shake de 250 mL. Incube a 50 °C, 200 rpm por 24 horas.
4. Colete 1 mL de cultura após a fermentação. Centrifuge a 13.800 × g por 2 minutos, dilua o sobrenadante 100 vezes com água ultrapura e meça a concentração de ácido L-lático por HPLC. Use três frascos independentes para cada geração.
5. Para obter a próxima geração, espalhe uma quantidade cheia da cultura da geração 1 em uma placa de ágar de semente fresca. Incube a 50 °C por 24 horas. Repita os passos 11.2 e 11.3 para a geração 2.
6. Repita o processo de subcultura para obter a geração 3 e a geração 4. Para cada geração, prepare três frascos agitados e meça a produção de ácido lático por HPLC.
7. Compare os rendimentos das quatro gerações (1–4) usando um ANOVA unidirecional ou teste t de Student. A cepa é considerada geneticamente estável se não houver diferença significativa (p > 0,05) na produção de ácido lático entre gerações.

Resultados

Com base na plataforma microfluídica automatizada de gotículas, foi estabelecido um modelo de triagem de alto rendimento. Uma biblioteca mutante de B. coagulans foi construída por mutagênese por ARTP com tempo ótimo de irradiação de 20 s, o que proporcionou uma taxa de letalidade de aproximadamente 90% (Figura 4A). As células mutantes foram então encapsuladas em gotículas de 14 pL, aproximadamente 30 μm de diâmetro, a uma taxa de geração de 1500 Hz ...

Discussão

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho padronizado para triagem microbiana industrial baseado em uma plataforma microfluídica automatizada de gotículas. O fluxo de trabalho integrado abrange a construção de bibliotecas mutantes, geração de gotículas e encapsulamento de célula única, cultivo de microreatores, injeção de biosensores, separação de gotículas ativadas por fluorescência e validação final de cepas-alvo. Utilizando a triagem de alto rendimento de um B. coagulans ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agar	Becton, Dickinson and Company	214030	Para preparação de placas sólidas
Anhydrous Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218	Limpar e desinfetar bancadas e aparelhos de laboratório
Atmospheric and Room Temperature Plasma (ARTP)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-002	ARTP  foi empregado para construir a biblioteca de mutantes para a mutagenese de linhagens.
B. coagulans	Beijing Microbial Culture Collection Center, BMCC	1511C0004000002355	B. coagulans ATCC 7050 foi usado como a linhagem inicial para a mutagenese e o alvo da triagem de gotículas de alta produtividade.
Black microplate (96 well)	Corning	3925	A microplaca preta de 96 poços foi usada para ensaios de sensor de lactato e determinação da concentração de ácido láctico.
Calcium carbonate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20011062	Para isolar hiperprodutores de L-ácido lático.
Calcium chloride	Sinopharm	10005819	O cloreto de cálcio é usado para a preparação do meio de cultura microbiana, fornecendo nutrientes essenciais para o crescimento microbiano.
Calcium L-lactate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	69027528	Usado como amostras para a preparação da curva padrão no processo de detecção.
Centrifuge tube (15 mL)	Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd	HB53397	Usado para diluição de líquido bacteriano
Collection tube	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell-CL	Para coletar gotículas e cultivo subsequente
Computer	Lenovo	E450	Instalação de software e controle do DREM Cell.
DAPI	Solarbio	c0065	Para coloração celular.
Deep-well plate (24-well)	BKMAMLAB	110424008	Para a verificação inicial do rendimento de mutantes de B. coagulans usando placas de poço profundo
Demulsifier (1H,1H,2H,2H-Perfluorooctanol)	MACKLIN	H817022	O desemulsificador de gotículas é usado para quebrar as microgotículas de água em óleo e liberar as células internas, linhagens ou supernatante para detecção e análise subsequentes.
D-Glucose	Solarbio	G8150-1000	D-Glucose é usado para a preparação do meio de cultura microbiana, fornecendo nutrientes essenciais para o crescimento microbiano.
Diammonium hydrogen citrate	Solarbio	D9950	O citrato de diamônio e hidrogênio é usado para a preparação do meio de cultura microbiana, fornecendo nutrientes essenciais para o crescimento microbiano.
Dipotassium hydrogen phosphate anhydrous	Sigma-Aldrich	P8281	O fosfato de dipotássio e hidrogênio anidro é usado para a preparação do meio de cultura microbiana, fornecendo nutrientes essenciais para o crescimento microbiano.
DREM Software version	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell v02.01.18	Para controlar o instrumento DREM cell. O Software DREM é um programa comercial proprietário exclusivamente para o instrumento DREM Cell da Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. Não possui acesso público oficial ou URL de download e é distribuído apenas com o instrumento sob autorização.
Droplet Entrapping Microfluidic Cell-sorter (DREM Cell)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-027	Foi usado para encapsulação e triagem de células únicas de alta produtividade e para triagem rápida de linhagens de alto rendimento da biblioteca de mutantes.
Droplet generation chip	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-009	O chip de geração de gotículas é usado para produzir gotículas monodispersas em escala de picolítero (pL) para encapsulação de células únicas.
Droplet injection chip	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-003	O chip de microinjeção de gotículas é usado para alcançar uma injeção precisa e traço de reagentes em gotículas pré-formadas para reações bioquímicas subsequentes.
Droplet sorting chip	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-002	O chip de triagem de gotículas é usado para classificar gotículas-alvo contendo células de alto rendimento com base em sinais de fluorescência.
Erlenmeyer shake flask (250 mL)	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-001006	Usado para a verificação da cultura em escala de linhagens mutantes de B. coagulans após a triagem primária com placas de poço profundo, para confirmar a estabilidade e a reprodutibilidade das linhagens de alto rendimento.
Filter Membranes (0.22 μm)	Merck	SLGPR33RB	Usado para filtração do caldo de fermentação.
Fluorescence inverted microscope	Olympus	IX73	O microscópio de inversão de fluorescência Olympus IX73 foi usado para observar a morfologia bacteriana dentro das gotículas
Fluorinated Oil	Bio-Rad	1864006	O óleo fluorado serve como a fase contínua na microfluídica de gotículas para gerar microgotículas de água em óleo estáveis, monodispersas e não interferentes, suportando o cultivo e a triagem de células únicas.
High Performance Liquid Chromatography column	Bio-Rad	Bio-Rad Aminex HPX-87	É usado para separar o ácido láctico de outros componentes no caldo de fermentação de acordo com suas diferentes propriedades de retenção, para realizar a detecção quantitativa precisa do ácido láctico.
High-Performance Liquid Chromatography	Shimadzu	228-34001-02	HPLC é usado para a detecção e análise quantitativa de ácido L-lático em amostras de fermentação.
Injection tube	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell-1N	Para injetar a fase oleosa, suspensão bacteriana de amostra e solução de reagente
Iron(III) sulfate heptahydrate	Iron(III) sulfate heptahydrate	Iron(III) sulfate heptahydrate	Iron(III) sulfate heptahydrate
Laminar flow hood	Shanghai SHP Instrument Equipment Co., Ltd	SP20230501	Usado para operação asséptica no cultivo e fermentação de B. coagulans.
Magnesium sulfate heptahydrate	Sinopharm	10013018	Extrato de Levedura é usado para a preparação do meio de cultura microbiana, fornecendo nutrientes essenciais para o crescimento microbiano.
Manganese sulfate monohydrate	MACKLIN	M813856	O sulfato de manganês monoidratado é usado para a preparação do meio de cultura microbiana, fornecendo nutrientes essenciais para o crescimento microbiano.
Microplate reader	TECAN	TCAT920000