Ensaios simples e acessíveis para eclosão de ovos em Caenorhabditis elegans: Formatos Adaptáveis para Testes de Drogas

Resumo

Este estudo apresenta uma plataforma flexível e padronizada de ensaios de eclosão de ovos em Caenorhabditis elegans , que integra múltiplos formatos experimentais. A abordagem aprimora a reprodutibilidade, escalabilidade e acessibilidade, permitindo uma avaliação robusta dos efeitos dos medicamentos e processos de desenvolvimento, mantendo-se econômica e facilmente adaptável tanto para aplicações de pesquisa quanto para ambientes educacionais.

Resumo

Ensaios de eclosão de ovos (EHA) são amplamente utilizados para avaliar os efeitos de compostos químicos nos estágios iniciais de desenvolvimento dos nematóides, especialmente em pesquisas antihelmínticas. No entanto, as metodologias existentes variam substancialmente em formato, complexidade e reprodutibilidade, e frequentemente são apresentadas como protocolos fixos em vez de estruturas experimentais adaptáveis. Neste estudo, estabelecemos uma plataforma simples, acessível e flexível para ensaios de eclosão de ovos em Caenorhabditis elegans , integrando e comparando diretamente três configurações experimentais: (i) incubação controlada em tubos de microcentrífuga seguida de semeadura em placas de ágar, (ii) exposição direta em placas de ágar contendo fármacos, e (iii) ensaios líquidos baseados em múltiplos poços. Dois compostos representativos foram usados para ilustrar o ensaio: um que inibe a eclosão dos ovos e outro que não tem efeito detectável. Cada configuração oferece vantagens distintas em termos de controle experimental, taxa de transferência e acessibilidade. A abordagem baseada em tubo de microcentrífuga permite um controle preciso da exposição a medicamentos e apoia análises farmacológicas quantitativas. Ensaios baseados em ágar oferecem uma alternativa simplificada e de baixo custo, adequada para exposição contínua e ambientes educacionais. Formatos multipoço permitem triagem escalável e padronizada, consistente com pipelines modernos de descoberta de medicamentos. Ao comparar diretamente esses formatos, mostramos como as escolhas metodológicas influenciam a reprodutibilidade do ensaio, a dinâmica da exposição a medicamentos e a interpretação biológica, especialmente em relação a fatores específicos de cada estágio, como o papel protetor da casca do ovo e a variação do desenvolvimento na expressão molecular do alvo. No geral, este trabalho estabelece os ensaios de eclosão de ovos em C. elegans como uma plataforma versátil e escalável, adaptável a diversas aplicações, incluindo triagem antihelmíntica, avaliação toxicológica, estudos de desenvolvimento e laboratórios de ensino, facilitando assim o uso mais amplo e racional dessa metodologia.

Introdução

Os ensaios de eclosão de ovos (EHA) há muito tempo são estabelecidos como uma metodologia fundamental em nematologia para avaliar a atividade ovicida e os efeitos iniciais do desenvolvimento de compostos químicos. Originalmente desenvolvidos para nematoides parasitas, esses ensaios quantificam a inibição da embrionação ou emergência larval sob condições in vitro controladas, fornecendo desfechos robustos e biologicamente relevantes, como a porcentagem de eclosão ou análise concentração-resposta (por exemplo, EC₅₀ ou IC₅₀)1,2,3,4,5,6,7.

Abordagens clássicas baseadas em ovos em nematoides parasitas como Haemonchus contortus e Trichostrongylus colubriformis têm sido amplamente utilizadas para avaliar a eficácia de medicamentos sintéticos e produtos naturais, bem como para monitorar a resistência antihelmíntica 1,2,6,8,9,10 . Essas metodologias abrangem uma variedade de leituras, desde a avaliação direta da viabilidade e eclosão dos ovos até a avaliação do desenvolvimento larval após a cultura fecal. Coletivamente, eles desempenharam um papel central na ligação da exposição a drogas à produção reprodutiva e ao potencial de transmissão de parasitas. No entanto, essas abordagens frequentemente exigem preparação complexa de amostras a partir de hospedeiros infectados, períodos prolongados de incubação e infraestrutura especializada, o que pode limitar sua acessibilidade, escalabilidade e reprodutibilidade interlaboratorial.

O uso de Caenorhabditis elegans como organismo-modelo surgiu como uma estratégia poderosa para superar várias limitações associadas aos nematoides parasitas. Seu curto ciclo de vida, tratabilidade genética, facilidade de cultivo e conservação de alvos moleculares chave compartilhados com espécies parasitas o tornam particularmente adequado para estudos farmacológicos, toxicológicos e de desenvolvimento. Importante destacar que a embriogênese em C. elegans é rápida e altamente reproduzível, permitindo que ensaios de viabilidade de ovos e eclosão sejam usados como leituras quantitativas e confiáveis dos processos iniciais de desenvolvimento e sua interrupção por xenobióticos 11,12,13,14,15,16,17.

Além disso, a disponibilidade de cepas mutantes bem caracterizadas permitiu insights mecanicistas sobre a ação e resistência de medicamentos. Estudos anteriores mostraram que a resistência a compostos bioativos pode surgir de forma dependente do estágio, com estágios embrionário e larval apresentando sensibilidade diferencial. Por exemplo, alterações na sinalização glutamatérgica foram associadas a fenótipos resistentes em larvas, enquanto a eclosão dos ovos permaneceu não^afetada 14,18,19,20. Isso destaca a natureza específica de estágio da sensibilidade a medicamentos e sugere que estágios embrionários podem envolver alvos distintos ou acessibilidade diferenciada em comparação com estágios de desenvolvimento posteriores.

Além da parasitologia, os ensaios de viabilidade de óvulos em C. elegans tornaram-se cada vez mais relevantes em toxicologia e na descoberta inicial de medicamentos. Esses ensaios foram aplicados não apenas para avaliar a atividade antihelmíntica, mas também para avaliar toxicidade do desenvolvimento e defeitos embrionários induzidos por medicamentos, com resultados que podem se correlacionar com perfis de toxicidade de organismos mais^{elevados 15,16}. Ao mesmo tempo, a presença da casca do ovo introduz importantes restrições biológicas, pois atua como uma barreira protetora e seletiva de permeabilidade ao redor do embrião^21,22. Como resultado, algumas moléculas bioativas podem não alcançar o embrião, apesar de apresentarem atividade em estágios posteriores de^{desenvolvimento} 14,19,23,24. O acesso ao embrião, portanto, provavelmente dependerá das propriedades fisicoquímicas de cada composto, incluindo tamanho molecular e polaridade. Isso pode contribuir para as diferenças entre a atividade observada em ensaios de eclosão de ovos e a dos estágios posteriores do desenvolvimento. Essa distinção ressalta a importância de definir claramente tanto o contexto experimental quanto o ponto final biológico que está sendo medido.

Metodologicamente, ensaios de eclosão de ovos em Caenorhabditis elegans foram implementados usando uma ampla gama de formatos experimentais, incluindo incubação líquida de ovos sincronizados, exposição direta a placas de ágar contendo fármacos e ensaios baseados em múltiplos poços adaptados para triagem de média a alta capacidade 11,13,14,16,19,23,24.

Formatos à base de líquidos e microplacas foram amplamente adotados em estudos de triagem farmacológica, pois fornecem condições de exposição homogêneas, facilitam o controle preciso das concentrações de medicamentos e permitem a análise quantitativa das relações concentração–resposta. Paralelamente, estratégias comparáveis baseadas em multipoços foram amplamente desenvolvidas para nematoides parasitas, variando desde ensaios convencionais de 96 poços até plataformas de ultra-alto rendimento^{usando formatos 4,5} de 384 poços^. Juntas, essas abordagens destacam a versatilidade e escalabilidade dos ensaios de eclosão de ovos entre diferentes espécies de nematoides e sua adaptabilidade a diversos ambientes experimentais, desde estudos mecanicistas em pequena escala até triagem composta em grande escala.

Cada formato apresenta vantagens e limitações distintas em termos de controle experimental, reprodutibilidade, taxa de transferência e acessibilidade. Ensaios à base de líquidos fornecem condições de exposição homogêneas e são bem adequados para análises farmacológicas quantitativas, enquanto ensaios baseados em ágar permitem exposição contínua durante todo o desenvolvimento, mas introduzem variabilidade relacionada à difusão e biodisponibilidade de fármacos. Formatos multipoço, por sua vez, permitem paralelização e redução do consumo de reagentes, alinhando-se com as estratégias modernas de triagem.

Apesar do uso generalizado, os ensaios de eclosão de ovos são frequentemente apresentados como protocolos fixos, em vez de uma estrutura metodológica flexível. Comparações diretas entre formatos são escassas, e as orientações sobre a seleção da configuração mais apropriada para aplicações específicas, que vão de estudos mecanicistas a ambientes de triagem ou ensino de alta produção, permanecem limitadas.

Neste estudo, propomos uma plataforma simples, acessível e adaptável para ensaios de eclosão de ovos em C. elegans, integrando e comparando três configurações experimentais: (i) incubação controlada em tubos de microcentrífuga seguida de semeadura em placas de ágar, (ii) exposição direta em placas de ágar contendo fármacos, e (iii) ensaios líquidos baseados em múltiplos poços.

Ao avaliar sistematicamente essas configurações, buscamos estabelecer uma estrutura prática que destaque as concessões entre controle experimental, simplicidade e escalabilidade. Essa perspectiva integrada conecta metodologias parasitológicas clássicas com abordagens modernas baseadas em modelos de triagem, posicionando os ensaios de eclosão de ovos não como uma única técnica padronizada, mas como uma plataforma versátil adaptável a diversos contextos de pesquisa, incluindo descoberta de anti-hermínitica, avaliação toxicológica, biologia do desenvolvimento e aplicações educacionais.

Protocolo

1. Cepas e cultura de Caenorhabditis elegans

1. Utilize a cepa selvagem N2 (Bristol) e/ou a cepa transgênica PD4251 (ccIs4251; dpy-20(e1282)) para desenvolver e validar a metodologia^25,26. PD4251 expressa GFP, facilitando visualização e aplicações potenciais de imagem quando necessário, enquanto mostra respostas de eclosão e desenvolvimento indistinguíveis das observadas na cepa tipo selvagem N2 sob as condições experimentais usadas neste^{estudo 27}.
2. Obtenha cepas (por exemplo, cepa selvagem N2) do Centro Genético Caenorhabditis (CGC), apoiado pelo Escritório de Programas de Infraestrutura de Pesquisa dos Institutos Nacionais de Saúde (P40 OD010440).
3. Manter minhocas sob condições laboratoriais padrão a 18–25 °C em placas de ágar recém-preparadas com Meio de Crescimento Nematoide (NGM), semeadas com Escherichia coli OP50 como fonte de alimento. Prepare o NGM dissolvendo 16 g de ágar, 3 g de NaCl e 2,5 g de bactopeptona em 975 mL de água destilada ou ultrapura. Esterilize por autoclav. Após resfriar o meio a 55 °C, adicione soluções estéreis de tampão de fosfato de potássio (25 mL, 1 M, pH 6,0), CaCl₂ (1 mL, 1 M), MgSO₄ (1 mL, 1 M) e colesterol (1 mL, 5 mg/mL em etanol absoluto). Misture bem e despeje os pratos em condições estéreis.
4. Realizar manuseio, propagação e manutenção rotineiros seguindo procedimentos estabelecidos conforme descrito no WormBook e estudos^relacionados 24,26,28,29. Mantenha as minhocas em condições de não fome, garantindo a disponibilidade contínua de alimento bacteriano e evitando pratos superlotados. Mantenha as culturas dentro da faixa de temperatura recomendada (18–25 °C) e evite condições excessivamente secas, pois elas podem acelerar a desidratação do ágar.
5. Considerações gerais antes de iniciar o ensaio
   1. Defina todos os parâmetros experimentais antecipadamente, incluindo temperatura (18–25 °C), tempo de incubação (4–8 h), umidade (50–70%) e procedimentos de manuseio.
   2. Prepare todos os materiais antes de iniciar o ensaio para garantir o tempo adequado e a coordenação do fluxo de trabalho.
   3. Mantenha condições experimentais consistentes em todas as réplicas para minimizar a variabilidade.

2. Preparação de compostos e controles de teste

1. Prepare todos os compostos frescos no dia do experimento. Estoques de dissolução em tampão M9 (22 mM KH₂PO₄, 42 mM Na₂HPO₄, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO₄) ou água destilada estéril, dependendo da compatibilidade do composto e das condições^{de ensaio 30,31}.
   NOTA: A escolha do meio aquoso pode influenciar a atividade dos compostos nos ensaios de C. elegans . Por exemplo, compostos como a serotonina podem apresentar diferentes concentrações efetivas quando preparados em água destilada estéril em comparação com o tampão M9. Portanto, tanto a compatibilidade do veículo quanto a resposta biológica devem ser avaliadas empiricamente durante a otimização do ensaio. Além disso, para compostos com baixa solubilidade aquosa, veículos apropriados como dimetilsulfóxido (DMSO) ou etanol podem ser utilizados. As concentrações finais de solvente devem permanecer baixas (tipicamente abaixo de 0,2% v/v) para evitar toxicidade. Estudos anteriores em C. elegans relataram que concentrações de DMSO de até 0,5% produzem efeitos mínimos sob condições laboratoriais^{padrão 17}.
2. Prepare pelo menos cinco concentrações por composto para permitir a construção de curvas concentração–resposta e a estimativa dos valores IC₅₀ ou IC₉₀ . Use uma diluição serial com etapas de concentração de 2 a 3 como ponto de partida e ajuste a faixa final de concentração de acordo com a potência esperada, solubilidade e resposta experimental de cada composto.
   NOTA: Se os compostos de teste forem sensíveis à luz, todas as etapas de preparação devem ser realizadas sob luz fraca para evitar degradação. Isso inclui preparar soluções de stock, diluições e placas de ágar contendo medicamentos. Sempre que possível, os pratos devem ser cobertos com papel alumínio e armazenados no escuro. Da mesma forma, placas multipoço devem ser mantidas cobertas (por exemplo, com papel alumínio ou tampas opacas) durante a incubação. Recomenda-se o uso de recipientes fechados ou câmaras úmidas que limitem a exposição à luz para manter a estabilidade do composto durante todo o experimento.
3. Inclua os seguintes controles em cada experimento: controle apenas com tampão (M9 ou água) e controle de veículo (por exemplo, DMSO ou etanol na mesma concentração usada nos tratamentos).
   NOTA: A escolha do solvente é fundamental. DMSO e etanol são comumente usados porque dissolvem compostos hidrofóbicos enquanto permanecem biocompatíveis em concentrações baixas. Abordagens alternativas, como Tween 20 ou ciclodextrinas, podem ser consideradas para melhorar a solubilidade. Soluções medicamentosas devem ser usadas imediatamente após a preparação, pois a estabilidade ao longo do tempo pode variar e afetar a reprodutibilidade.

3. Obtenção sincronizada de ovos de C. elegans

NOTA: O isolamento dos ovos de C. elegans foi amplamente descrito em estudos anteriores^29,32. Aqui, os principais passos são resumidos, incorporando pequenas modificações para otimizar a recuperação de ovos limpos e livres de detritos, adequados para ensaios de eclosão de ovos.

1. Coleção de vermes grávidos
   1. Comece com 3–5 placas NGM contendo culturas confluentes de adultos^{grávidos 25,26}. Prefira placas contendo grande número de vermes grávidos e ovos visíveis, indicando reprodução ativa, evitando culturas superlotadas ou famintas. A contagem exata de vermes normalmente não é determinada nesta fase, pois protocolos de isolamento de ovos em C. elegans geralmente dependem de culturas reprodutivas confluentes em vez de contagens precisas de animais. Como referência geral, cada placa de 60 mm deve conter várias centenas de adultos grávidos.
   2. Adicione água destilada em cada prato e lave suavemente as minhocas em um tubo cônico de 15 mL. Evite raspar a superfície do ágar para minimizar os detritos.
   3. Centrifuge a 266 × g a 3 min (18–25 °C) para pelletar as minhocas. Remova as bactérias que contêm sobrenadante.
   4. Remova o sobrenadante e repita a etapa de lavagem três vezes. Ressuspenda o pellet suavemente cada vez para melhorar a remoção das bactérias residuais.
2. Isolamento de ovos por branqueamento
   1. Ressuspenda o pellet de minhoca em uma solução de branqueamento recém-preparada (1,2% NaOCl e 0,5 M NaOH; volume final 5 mL). Prepare a solução imediatamente antes do uso para garantir a atividade.
      NOTA: Amostras corretamente branqueadas foram definidas como preparações em que carcaças adultas foram interrompidas/digeridas, enquanto ovos intactos permaneceram morfologicamente normais e viáveis. Amostras excessivamente branqueadas foram identificadas por ovos danificados ou lisados, morfologia anormal dos ovos, redução das taxas de eclosão ou ausência de larvas viáveis após^{a incubação 25}.
   2. Agite vigorosamente o tubo para promover a dissolução dos corpos adultos e a liberação dos óvulos. Misture continuamente durante a incubação para garantir uma exposição uniforme.
   3. Monitore a reação de perto e não ultrapasse 5 minutos. Verifique visualmente: os corpos adultos devem estar em sua maioria dissolvidos enquanto os ovos permanecem intactos.
   4. Monitore a reação de perto e pare em 5 minutos, adicionando água destilada fria e estéril (de preferência 10 °C) até um volume final de 14 mL. Não permita que a incubação ultrapasse esse tempo para evitar danos aos ovos.
   5. Tampe o tubo e inverta suavemente várias vezes para diluir rapidamente a solução branqueante. Realize essa etapa sem demora para preservar a viabilidade dos ovos.
   6. Centrifuge a 266 × g por 3 minutos (18–25 °C) e descarte cuidadosamente o sobrenadante.
   7. Lave o pellet de ovo três vezes com água destilada estéril para remover completamente o alvejante residual. Garanta uma resuspensão completa entre as lavagens. Resuspenda os ovos em 5 mL de tampão M9 ou água estéril.
      NOTA: Branquear hermafroditas grávidas resulta em uma preparação de ovos estéril, adequada para ensaios sincronizados. Na ausência de alimento, as larvas eclodentes entram em parada de desenvolvimento L1 e retomam o desenvolvimento de forma síncrona após a alimentação.
3. Etapa de purificação (flotação de sacarose)
   1. Realize essa etapa se restos de minhoca estiverem visíveis após o branqueamento.
   2. Prepare uma solução de sacarose a 30% diluindo uma solução estéril de estoque de sacarose a 60% (por exemplo, misture em volumes iguais: 5 mL de sacarose a 60% com 5 mL de água destilada).
   3. Adicione a solução de sacarose ao pellet e misture suavemente por inversão. Evite o vórtice.
      NOTA: Como essa etapa de purificação é breve e seguida por etapas imediatas de lavagem para remover a sacarose residual, não foram observados efeitos detectáveis na viabilidade do ovo nas condições utilizadas neste estudo. Em contraste, a remoção de detritos de vermes melhora substancialmente a visualização dos ovos, a precisão da contagem e a uniformidade da exposição a medicamentos entre amostras.
   4. Centrifuge a 266 × g por 5 min (18–25 °C).
   5. Identifique a camada de ovos como um anel branco fino no topo da solução. Imediatamente colete 4 mL do ovo contendo sobrenadante, movendo cuidadosamente a ponta da pipeta ao longo do anel.
   6. Realize essa etapa rapidamente, pois os ovos começam a afundar logo após a centrifugação devido à gravidade.
   7. Transfira o sobrenadante coletado para um tubo limpo contendo água destilada estéril. Lave os ovos duas vezes com água fria e estéril para remover o resíduo de sacarose.
      NOTA: Essa etapa é opcional, mas fortemente recomendada. Remover detritos melhora a precisão da visualização e contagem dos ovos, e garante uma exposição mais uniforme aos compostos testados ao evitar que os ovos fiquem presos no material residual de vermes.
4. Preparação da solução de caldo de ovos
   1. Misture a suspensão dos ovos delicadamente antes de amostrar, pois os ovos sedimentam rapidamente.
   2. Coloque três gotas de 20 μL em uma lâmina e conte os ovos sob um estereoscópio.
   3. Calcule a média e ajuste a concentração para 50–100 ovos por 100 μL usando o tampão M9. Misture novamente antes de alicotar para manter a distribuição uniforme.
   4. Aliquota o volume necessário de suspensão de ovos para cada condição experimental de acordo com o protocolo selecionado.

4. Formatos de ensaio de eclosão de ovos

1. Exposição de ovos de curto prazo em tubos microcentrífugas (formato de alto controle)
   NOTA: Esta configuração experimental baseia-se nos procedimentos²⁵ descritos anteriormente, com adaptações para melhorar o controle sobre as condições de exposição e a reprodutibilidade.
   1. Preparação de placas de ágar para ensaios de eclosão de ovos
      1. Prepare placas de ágar sem medicamentos usando ágar e água destilada apenas (1,7 g de ágar em 100 mL de água). Não adicione nutrientes ou bactérias, pois o objetivo é avaliar a eclosão dos ovos sem interferência das fontes de alimento. Despeje aproximadamente 3 mL de ágar por placa de Petri de 35 mm para manter uma profundidade consistente de ágar entre os experimentos.
      2. Prepare os pratos 12–24 horas antes do uso. Evite ultrapassar esse período, pois a secagem excessiva reduz a viabilidade dos ovos e afeta o movimento larval.
      3. Divida cada placa em quatro quadrantes após a solidificação para facilitar a contagem.
      4. Armazene os pratos a 8–10 °C em condições seladas para evitar desidratação. Deixe as placas se equilibrarem com a temperatura ambiente antes do uso.
   2. Transfira 500 μL de suspensão de ovo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para cada condição. Misture suavemente entre as etapas de pipeteamento para evitar a sedimentação dos ovos, pois os ovos se assentam rapidamente pela gravidade. Manter uma suspensão homogênea é fundamental para garantir números comparáveis de óvulos em diferentes condições.
   3. Adicione 500 μL de solução de tratamento ou controle correspondente à suspensão de ovo de 500 μL. Incubar a 22 °C por 4–8 horas. Defina o tempo de incubação com antecedência e mantenha-o constante entre os experimentos (por exemplo, 6 horas), pois as variações nesse tempo afetam diretamente a exposição ao medicamento.
      NOTA: Prepare as soluções de tratamento a 2x a concentração final desejada para que a diluição após a mistura com a suspensão de ovo produza a concentração final de trabalho pretendida.
   4. Mantenha uma agitação suave contínua durante a incubação usando um rotador tubular (por exemplo, rotação vertical de 5–20 rpm) ou plataforma de balanço. Certifique-se de que os tubos permaneçam em movimento constante para evitar sedimentação de ovos e promover uma exposição uniforme. Essa etapa é crítica, pois condições estáticas levam ao acúmulo de óvulos e à exposição heterogênea a medicamentos.
   5. Centrifuge os tubos a 3.420 × g por 3 minutos (18–25 °C) após a incubação. Identifique o pellet, que aparece como um pequeno depósito branco na parede do tubo. Oriente os tubos de forma consistente (por exemplo, marque um lado) antes da centrifugação para facilitar a rápida localização dos pellets e evitar perdas acidentais durante a remoção do sobrenadante.
   6. Remova o sobrenadante com cuidado, sem mexer na bola. Lave os ovos três vezes com tampão M9 para eliminar o composto residual. Resuspenda o último pellet em 240 μL de tampão M9.
   7. Placar a suspensão sobre placas de ágar dispensando 20 μL por quadrante. Use três placas por condição. Deixe as gotas secarem completamente antes de mover ou inverter as placas para evitar o deslocamento dos ovos pela superfície.
      NOTA: Comece com um volume total maior de suspensão de ovos do que o estritamente exigido para compensar a perda de ovos durante as etapas de lavagem e garanta amostra final suficiente para placagem e contagem. Para simplificar o procedimento e reduzir o uso de placas de ágar, especialmente em ambientes de ensino, transfira os ovos ressuspensos diretamente para uma placa multipoço, em vez de para placas de ágar. Ajuste o volume final para 200 μL por poço e encha os poços não utilizados com água estéril para minimizar a evaporação.
2. Exposição direta a ovos em placas de ágar contendo medicamentos
   1. Prepare uma solução de ágar contendo apenas ágar e água destilada estéril (1,7 g de ágar em 100 mL). Aqueça até estar totalmente dissolvido e mantenha a solução em forma líquida. Deixe o ágar esfriar até 50–55 °C antes de adicionar qualquer composto e monitore a temperatura usando um termômetro de laboratório. Essa etapa é fundamental para preservar a estabilidade do composto e garantir uma incorporação homogênea, conforme descrito^{anteriormente 28}. Prepare pelo menos cinco concentrações por composto para permitir a análise concentração-resposta e a estimativa de IC₅₀ .
      NOTA: Não adicione fontes de alimento bacteriano. Na ausência de alimento, as larvas eclodentes entram em parada sincronizada do desenvolvimento L1, impedindo a progressão para estágios larvais posteriores durante o período^{de ensaio 26,33}.
   2. Adicione o volume apropriado de solução medicamentosa ou controle do veículo ao ágar resfriado. Misture suavemente por inversão lenta para garantir uma distribuição homogênea. Evite vórtices ou sacudidas vigorosas para evitar a formação de bolhas.
   3. Imediatamente despeje aproximadamente 3 mL de ágar em placas de Petri de 35 mm. Trabalhe de forma constante para manter a temperatura e a espessura da placa consistentes. Prepare pelo menos 3 a 5 placas por condição.
   4. Armazenamento e manuseio das placas da seguinte forma: Permitir que as placas solidifiquem em temperatura ambiente sobre uma superfície plana. Placas de armazenamento invertidas para evitar que a condensação atinja a superfície do ágar.
   5. Prepare o experimento: Semeie 50–100 ovos diretamente nas placas de ágar. Mantenha parâmetros experimentais constantes, incluindo temperatura, tempo de incubação, umidade e tempo de preparação da placa. Use pelo menos cinco concentrações para análise concentração–resposta.
      NOTA: Prepare os pratos de 12 a 24 horas antes do uso. Evite secar demais, pois isso pode afetar a viabilidade dos ovos e o movimento larval. Enrole placas para reduzir a desidratação e proteger da luz ao trabalhar com compostos sensíveis à luz. Armazene os pratos em um ambiente limpo, preferencialmente umidificado (por exemplo, um recipiente lacrado com papel úmido) para minimizar a variabilidade.
3. Ensaio de eclosão de ovos em placas multipoço (formato de média a alta capacidade)
   NOTA: Esse formato é amplamente utilizado tanto em estudos com C. elegans quanto em estudos de nematoides parasitas para triagem de médio a alto rendimento, permitindo a avaliação paralela de múltiplos compostos e concentrações sob condições padronizadas.
   1. Preparação de placas de poço e desenho experimental: Use placas de 96 poços (ou um formato alternativo dependendo das necessidades de throughput). Prepare o layout das placas com antecedência e defina concentrações de medicamentos (organizadas em colunas), réplicas (entre linhas) e controles, incluindo apenas tampão (M9 ou água) e controles de veículos (por exemplo, DMSO ou etanol na mesma concentração final usada nos tratamentos).
      NOTA: Use placas multipoço transparentes de fundo plano para permitir visualização direta e contagem em cada poço sob iluminação LED transmitida com um estereoscópio. Ovos e larvas de L1 eclodidas são quantificados diretamente nos poços sem etapas de transferência, minimizando a perda de amostras e o manuseio de artefatos.
   2. Pré-carregue cada poço com o volume apropriado de solução ou controle medicamentoso. Use volumes iguais em todos os poços.
   3. Adição de suspensão em ovo
      1. Prepare uma suspensão de ovos bem homogeneizada com concentração definida (ver Seção 2).
      2. Adicione um volume igual de Egg Suspension em cada poço que contenha a solução medicamentosa. Use um volume final de 200 μL por poço.
      3. Ajuste a densidade dos ovos para pelo menos 30 ovos por poço (idealmente 30–100). Não exceda 100 ovos por poço, pois a superlotação complica bastante a quantificação manual. Ovos individuais tornam-se difíceis de distinguir, enquanto larvas móveis de L1 nadam ativamente pelo poço, reduzindo a precisão da contagem e aumentando a variabilidade experimental.
      4. Misture delicadamente a suspensão de ovo antes de dispensar para garantir uma distribuição uniforme.
   4. Carregue a placa com cuidado. Evite introduzir bolhas de ar. Pipete consistentemente e troque as pontas entre as condições para evitar contaminação cruzada. Bata suavemente na placa para garantir que todo o conteúdo fique no fundo dos poços.
   5. Condições de incubação: Incubar a placa a 20–22 °C sob condições controladas e úmidas por um total de 24 horas após o isolamento do ovo.
      NOTA: Minimize a variabilidade evitando o uso de poços externos ou preenchendo-os com tampão para reduzir a evaporação. Incube placas em uma câmara umidificada (por exemplo, um recipiente lacrado com papel úmido) e proteja-as da luz ao trabalhar com compostos sensíveis à luz. Evite movimentos desnecessários durante a incubação. Mantenha um tempo consistente de preparação dos óvulos e exposição ao medicamento em todas as réplicas, pois variações podem afetar o estágio de desenvolvimento e a interpretação dos dados.

5. Avaliação e contagem

1. Avalie a eclosão dos ovos 24 horas após o isolamento, garantindo que as condições de controle tenham atingido a eclosão completa abaixo da temperatura definida. Calcule esse ponto de tempo a partir do momento da coleta dos óvulos para permitir um desenvolvimento embrionário suficiente. Considere quaisquer ovos que ainda não eclodiam nessa fase como afetados pelo tratamento.
2. Examine amostras sob um estereoscópio. Para cada condição (placas de ágar ou placas multipoço), quantifique o número de ovos não chocados e o número de larvas L1 eclodidas.
3. Escaneie toda a área de observação, incluindo bordas de placas e limites de poços, pois as larvas móveis de L1 podem se distribuir de forma desigual e se acumular nessas regiões.
   NOTA: Realize contagem direta sob um estereomicroscópio para avaliação rápida sem equipamentos adicionais. Mantenha densidade consistente de ovos em todas as condições, utilize pelo menos 3–5 réplicas técnicas por condição e realize no mínimo três experimentos independentes usando diferentes preparações de ovos para garantir comparações confiáveis.

6. Aquisição de imagens e documentação

1. Adquira imagens usando um estereoscópio equipado com uma câmera digital. Para placas de ágar, registre cada quadrante; Para placas multipoços, registre cada poço individual. Certifique-se de que todas as áreas sejam capturadas, incluindo bordas de placas e limites de poços, onde as larvas podem se acumular.
   NOTA: Oculares e objetivos padrão 10x, que variam de 0,6x a 5x (ampliação total de 6x a 50x), são amplamente utilizados e permitem visualização clara tanto dos ovos quanto das larvas L1 dentro da área de contagem. Use iluminação LED transmitida. Mantenha configurações constantes de aquisição da câmera (brilho, exposição e contraste) em todas as condições experimentais para garantir qualidade de imagem consistente e comparação confiável entre amostras.
2. Use softwares de aquisição adequados para capturar imagens. Processe e analise imagens usando softwares de análise de imagens. Mantenha parâmetros de análise idênticos em todas as condições experimentais, incluindo brilho, contraste, ampliação, mesma área/campo de aquisição e critérios de contagem.
3. Quantifique o número de ovos não chocados e larvas de L1 a partir das imagens adquiridas. Considere as larvas como eclodentes apenas quando eclodem completamente da casca do ovo. Ovos contendo larvas parcialmente emergidas devem ser classificados como não chocados. Aplicar critérios de classificação idênticos em todas as condições experimentais.
4. Incubar placas ou placas multipoço por mais 12–24 horas a 16–18 °C para avaliar se a inibição observada da eclosão dos ovos é reversível. Sob as condições experimentais definidas, os ovos que permanecem não eclodidos nessa fase são considerados afetados pelo tratamento.

7. Análise de dados

1. Calcule a inibição da eclosão dos ovos como:
   Fração de ovos não chocados = (Número de ovos não chocados) / (Número total de ovos + larvas)
2. Realize pelo menos 3 a 5 experimentos independentes usando diferentes lotes de ovos. Expresse os dados como média ± desvio padrão (média ± SD).
3. Gerar curvas concentração–resposta usando regressão não linear e determinar os valores IC₅₀ .
4. Realize comparações estatísticas entre condições usando o teste t de Student e defina significância estatística em p < 0,05.
5. Analise os dados usando um software estatístico apropriado.

8. Aplicação de ensaios de eclosão de ovos usando trans-cinnamaldeído e acetato de linalila

NOTA: Este estudo não é centrado em um composto específico, mas utiliza agentes representativos para ilustrar como cada formato experimental pode ser implementado, controlado e interpretado sob condições comparáveis. O trans-cinamaldeído (TCA) foi selecionado como composto ilustrativo porque já foi caracterizado anteriormente e produz consistentemente inibição robusta e reprodutível da eclosão dos ovos nas três configurações de ensaio apresentadas aqui. Importante, o objetivo de incluir a TCA era demonstrar a implementação do protocolo e o comportamento representativo de concentração–resposta, em vez de estabelecer potência relativa ou desempenho comparativo entre formatos.

1. Configuração experimental e preparação de compostos
   1. Prepare placas de ágar (3 mL por recipiente de 35 mm) com 12–24 horas de antecedência usando meio apenas de ágar (1,7% em água destilada). Rotule as placas, divida-as em quatro quadrantes para facilitar a contagem, armazene-as em condições seladas para evitar desidratação e equilibre-as até a temperatura ambiente antes do uso.
   2. Prepare soluções frescas de trans-cinnamaldeído (TCA) em DMSO e dilua-as em água ou ágar estéril para obter oito concentrações finais (0,05–0,7 mM). Mantenha a concentração final de DMSO abaixo de 0,2% em todas as condições. Inclua água, ágar e/ou DMSO como controles negativos e de veículos, respectivamente.
   3. Teste acetato de linalilo em 5 mM como controle de composto negativo para avaliar a capacidade do ensaio de discriminar entre compostos ativos e inativos sob condições experimentais idênticas.
   4. Prepare suspensões sincronizadas de ovos conforme descrito acima e ajuste a densidade para 50–100 ovos por 100 μL. Use volumes iguais e números comparáveis de ovos em todos os formatos para garantir consistência entre as condições.
2. Aplicação de formatos experimentais usando um composto de referência
   1. Exposição de curto prazo em tubos microcentrífugas (formato de alto controle)
      1. Misture 500 μL de suspensão de ovo com 500 μL de solução de tratamento contendo 0,05–0,7 mM de TCA. Incube os tubos por 6 horas a 18–20 °C e mantenha o tempo de incubação de forma consistente em todos os experimentos.
      2. Mantenha os tubos sob agitação suave contínua usando um rotador durante a incubação.
      3. Centrifuge os tubos a 3.420 × g por 3 minutos (18–25 °C) após a exposição e remova cuidadosamente o sobrenadante. Lave os ovos três vezes com água destilada para remover compostos residuais e limitar a exposição durante o período definido de incubação.
      4. Resuspenda o pellet final em água destilada de 240 μL e placue a suspensão em placas de ágar a 20 μL por quadrante usando três placas por condição. Incube as placas a 16–18 °C por 24 horas após o isolamento do ovo.
   2. Exposição direta a placas de ágar contendo fármacos
      1. Prepare placas de ágar contendo medicamentos adicionando soluções de TCA ao ágar resfriado a 50–55 °C e misturando delicadamente para garantir uma distribuição homogênea. Despeje aproximadamente 3 mL de ágar por placa e prepare as placas de 12 a 24 horas antes do uso.
      2. Os ovos de semente são depositados diretamente na superfície das placas com densidades comparáveis às usadas em outros formatos (50–100 ovos por 100 μL). Não execute etapas de lavagem nessa configuração.
      3. Incube as placas a 16–18 °C até 24 horas após o isolamento do ovo.
   3. Ensaio de placas multipoço (formato de média a alta produtividade)
      1. Precarregue as placas de 96 poços com soluções e controles medicamentosos. Adicione suspensões de ovos para obter um volume final de 200 μL por poço e uma densidade de 50–100 ovos por poço.
      2. Garantir uma distribuição homogênea durante a carga, evitando bolhas e mantendo volumes consistentes entre os poços. Incube as placas a 20–22 °C em condições úmidas por 24 horas após o isolamento do ovo.
3. Aquisição e quantificação de imagens
   1. Avalie a eclosão dos ovos 24 horas após o isolamento, uma vez concluída sob condições de controle. Conte o número de ovos não chocados e larvas L1 sob um estereoscópio para cada condição. Examine cuidadosamente as bordas das placas e os limites dos poços, pois as larvas podem se acumular nessas regiões.
   2. Adquira imagens usando um estereoscópio equipado com uma câmera digital para fins de documentação. Registre cada quadrante para placas de ágar e imageie sistematicamente cada poço para placas multipoços. Use softwares de análise de imagem quando necessário para suportar a quantificação.
   3. Incube as placas por mais 12 a 24 horas após a aquisição da imagem para avaliar se a inibição observada da eclosão é reversível.
   4. Realize todos os experimentos usando pelo menos três réplicas biológicas independentes.

Resultados

A TCA produziu uma inibição clara dependente da concentração da eclosão dos ovos em todos os formatos experimentais, como mostrado na Figura 1. Curvas representativas concentração-resposta são apresentadas para cada configuração de ensaio: tubos microcentrífugas (Figura 1A), exposição direta em placas de ágar (Figura 1B) e placas multipoço (Figura 1C).

Discussão

Este estudo apresenta uma plataforma simples e adaptável para ensaios de eclosão de ovos em Caenorhabditis elegans, estruturados em torno de três formatos experimentais complementares que diferem em controle, dinâmica de exposição e escalabilidade. Em vez de definir um único protocolo ótimo, nossos resultados apoiam a visão de que os ensaios de eclosão de ovos devem ser considerados uma estrutura metodológica flexível adaptável a objetivos experimentais específicos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bacteriological Agar	Britania	B0101406	deve ser preparado fresco (1,7 gr em 100 mL H2O)
Bleach solution	N/A	N/A	1,2 % (v/v) NaOH e 0,5 M NaOH
Centrifuge	ThermoScientific.	Sorvall ST16R.
Centrifuge	BiofugePICO para tubo eppendorf	Heraeus 75003235
Digital camera	ToupCam	TP605100A	Câmera digital industrial. Comprimento focal ajustável USB 2.0
DMSO	BioBasic	RAS#7-68-5	MW: 78,13
Linalil Acetate	SIGMA	No.CAS: 115-95-7	deve ser preparado fresco
Lysogeny broth (LB) medium	N/A	N/A	10 g Bacto-triptona, 5 g extrato de levedura, 10 g NaCl para 1 L de água destilada
M9 Buffer	N/A	N/A	3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g  NaCl, 0,25 g MgSO4 para 1 L de água destilada
Mini Rotator	BioSan	Bio RS-24
Nematode Growth Medium (NGM)	N/A	N/A	3 g NaCl, 17 g agar, 2,5 g  Bacto-Peptona para 1 L de água destilada. Esterilizado por autoclavagem. Suplementado com 1 mL de colesterol (5 mg/mL),  1 mL de CaCl2 (1 M), 25 mL de tampão de fosfato de potássio (1 M, pH 6,0) e 1 mL  MgSO4 (1 M)
Petri Dish (3 - 5 mm)	ThermoScientific. Nunclon DeltaSurface	153066
Petri Dish (90 mm x 15 mm)	ExtraGene	1026160305	Apenas para uso laboratorial, Poliestireno.
Pipette	Fisherbrand	N/A
SigmaPlot 12.0	Systat Software	N/A	Versão 12.0
Stereomicroscope	ARCANO	ZTX-T 1:4 LED	Estereomicroscópio trinocular (10x–40x magnificação total; iluminação incidente e transmitida por LED)
Sucrose	Laboratorio Cicarelli	Art 841	60 % (v/v) sacarose
Tissue culture plate 96 well	Biofil	TCP 012096	Poliestireno, Tampa de Baixa Evaporação.
ToupView	ToupTek Photonics	N/A
Transcinnamaldehyde (TCA)	Santa Cruz Biotechnology	J1712	Deve ser preparado fresco