Protocolos para Criação Eficiente e Análise Funcional da Vespa Endoparasitoide Asobara japonica e seu hospedeiro Drosophila melanogaster

Resumo

O objetivo deste protocolo é facilitar a análise funcional das interações parasitoide–hospedeiro em Asobara japonica e Drosophila melanogaster. Por meio de métodos otimizados de criação, um ensaio de infecção com oviposição única e knockdown gênico mediado por RNAi.

Resumo

Parasitismo é uma interação biológica na qual um organismo explora o corpo ou os recursos de outro (o hospedeiro), resultando em danos substanciais ou morte ao hospedeiro. Entre os animais parasitas, as vespas parasitoides são uma das linhagens mais ricas em espécies, representando quase 20% de todas as espécies de insetos. Em particular, as vespas endoparasitoides ovipositam diretamente no corpo do hospedeiro e utilizam uma diversidade de fatores venenosos para manipular o desenvolvimento, imunidade e fisiologia do hospedeiro. Em resposta ao ataque de vespas, os hospedeiros tentam eliminar ovos parasitoides por meio de mecanismos imunes inatos. No entanto, os mecanismos moleculares e celulares pelos quais os componentes individuais do veneno modulam a biologia do hospedeiro e promovem o parasitismo bem-sucedido permanecem pouco compreendidos. Aqui, descrevemos um protocolo laboratorial padronizado para a criação da vespa endoparasitoide Asobara japonica e de seu hospedeiro Drosophila melanogaster. Estão disponíveis cepas partenogenéticas e sexuais de A. japonica, e a cepa partenogenética apresenta alta taxa de sucesso no parasitismo, permitindo a manutenção estável dos estoques laboratoriais para análise genômica e ensaios de parasitismo. Um ensaio de infecção por oviposição simples e um método de knockdown gênico baseado em RNA de fita dupla foram otimizados para análise funcional de genes de veneno. Juntos, esses protocolos fornecem uma estrutura experimental prática para dissecar os mecanismos moleculares subjacentes às interações parasitoide-hospedeiro e facilitarão pesquisas futuras em biologia do desenvolvimento, imunologia e fisiologia.

Introdução

Parasitismo é um estilo de vida no qual um organismo explora os recursos nutricionais de outro e é amplamente distribuído entre táxons. Estima-se que até metade de todos os organismos conhecidos exibam parasitismo em seu ciclo^{de vida 1}. Entre os parasitas, as vespas parasitoides são um grupo particularmente diverso, representando aproximadamente 20% de todos os^{insetos 2}. Eles exploram uma ampla variedade de hospedeiros artrópodes, como insetos, aranhas e ácaros, e exibem notável diversidade em suas histórias de vida e estratégias^{parasitárias 3}. Essas características fazem das vespas parasitoides um dos grupos de insetos mais bem-sucedidos evolutiva e ecologicamente.

Interações entre parasitoides e seus hospedeiros foram amplamente estudadas como sistemas-modelo de "corridas armamentistas" evolutivas. Em particular, vespas endoparasitoides utilizam uma variedade diversa de fatores, incluindo venenos, vírus simbióticos e teratocitos ^4,5. Esses fatores manipulam a fisiologia e o desenvolvimento do hospedeiro, garantindo assim o desenvolvimento bem-sucedido dentro do hospedeiro. Apesar desses avanços, os mecanismos moleculares subjacentes ao parasitismo permanecem pouco compreendidos na maioria das espécies parasitoides. Uma das principais limitações é o pequeno tamanho corporal deles, que dificultou a identificação bioquímica dos componentes do veneno. Além disso, é tecnicamente desafiador manter parasitoides e seus hospedeiros com estágios de desenvolvimento sincronizados sob condições laboratoriais.

Avanços recentes em sequenciamento de próxima geração e outras tecnologias de mics agora possibilitam análises genômicas em todo o genoma, mesmo em espécies parasitoides muito pequenas. Essas abordagens abriram novas vias para investigar mecanismos moleculares antes inacessíveis, permitindo que as interações parasitoide e hospedeiro sejam estudadas com resolução sem precedentes. Nesse contexto, nosso laboratório foca em Asobara japonica Belokobylskij  (Hymenoptera: Braconidae), uma espécie originalmente identificada no^{Japão 6,7,8}. A. japonica inclui uma cepa partenogenética thelytokous, na qual as fêmeas produzem descendentes sem acasalamento. Esse recurso nos permite coletar quantidades substanciais de DNA genômico geneticamente uniforme para sequenciamento do genoma^{inteiro 9}. Além disso, essa espécie parasita uma ampla gama de espécies de Drosophila, incluindo o organismo-modelo D. melanogaster,  que oferece grandes vantagens experimentais devido às suas condições de criação bem estabelecidas e estágios de desenvolvimento precisamente definidos, permitindo ensaios de infecção reprodutíveis e controle preciso do desenvolvimento^{parasitoide 10}.

Durante o parasitismo de A. japonica, uma vespa fêmea injeta veneno junto com um único ovo em uma larva de mosca, dentro da qual uma larva de vespa cresce junto com seu hospedeiro. Notavelmente, A. japonica apresenta alta taxa de sucesso de parasitismo no hospedeiro D. melanogaster, tornando esse par parasitoide-hospedeiro um modelo experimental poderoso. Aqui, descrevemos protocolos para criação estável, um ensaio de infecção por ovoposição simples e um método de knockdown gênico baseado em RNA dupla fita (dsRNA) em A. japonica. Esses protocolos fornecem uma estrutura confiável para dissecar mecanismos moleculares subjacentes às interações parasitoide-hospedeiro.

Protocolo

Uma visão geral esquemática do método de criação sincronizada para D. melanogaster e A. japonica é apresentada na Figura 1.

1. Criação da mosca-das-frutas hospedeira Drosophila melanogaster em laboratório

1. Mantenha todos os animais experimentais em 25 °C e umidade relativa de 50-60% sob um ciclo de 12:12 horas de luz/escuro. Use a cepa selvagem Oregon-R (OR) como hospedeira para A. japonica (Figura 2A).
2. Transfira as moscas adultas para um novo frasco alimentar contendo meio padrão de farinha de milho, fermentação e ágar (0,55% de ágar, Tabela 1). Rotule o frasco com a data de transferência e o nome da cepa "OR".
3. Elimine essas moscas adultas um dia após a transferência para evitar um número excessivo de ovos na comida. Certifique-se de que as larvas da prole estejam se alimentando na superfície do alimento.
   NOTA: Como orientação, mantenha aproximadamente 200-250 ovos por frasco de alimento (φ30×100 mm). Densidades maiores de ovos podem reduzir o sucesso do parasitismo e aumentar a variação no desenvolvimento do hospedeiro e da vespa.
4. Quatro dias após o Passo 1.2, transfira uma colher de larvas de mosca (4 dias após a postura dos ovos, dAEL) para um novo frasco de alimento. Mantenha essas larvas sem exposição a parasitoides pela próxima geração. Esse procedimento também ajuda a controlar a densidade larval do hospedeiro em um frasco.

2. Criação da vespa endoparasitoide Asobara japonica em laboratório

1. Use uma cepa partenogenética Tokyo (TK) e uma cepa sexual Iriomote-jima (IR) (Figura 2B). A primeira é composta por fêmeas, enquanto a segunda é composta por fêmeas e machos. Os machos nascem dois a quatro dias antes do que as fêmeas. Portanto, confirme a presença das fêmeas por meio de seus ovipositores antes da transferência.
2. Transfira de 10 a 20 vespas adultas diretamente do frasco de estoque para o frasco contendo larvas de mosca a 4 dAEL. Rotule o frasco com a data de transferência e o nome da cepa "TK" ou "IR". Mantenha as vespas nas mesmas condições do Passo 1.1.
3. Permita que vespas adultas oviponham nas larvas de mosca. Elimine essas vespas um a dois dias depois para evitar superparasitismo, que pode levar à morte do hospedeiro. Remova moscas adultas eclosionadas que escaparam do parasitismo 10 ou mais dias após o Passo 2.2.
4. Duas semanas após o Passo 2.2, as vespas adultas começam a se fechar do caso pupal da mosca hospedeira. Transfira essas vespas adultas recém-fechadas para um novo frasco com papel filtrante contendo 25% de glicose e 50 mM de solução de vitamina C. Os pedaços de papel de filtro devem ser esterilizados a 130 °C por 2 horas. Fornecer a solução em papel de filtro promove comportamentos de oviposição e prolonga a vida das vespas adultas. Nossa abordagem para usar vitamina C para melhorar a oviposição foi inspirada por observações de estudos com Drosophila ¹¹.

3. Ensaio de Infecção por Oviposição Única

1. Sincronize o estágio de desenvolvimento das larvas de mosca usadas no experimento de infecção.
   1. Coloque as moscas adultas em um tubo de 50 mL contendo uma placa de ágar com suco de uva (ágar a 3%) espalhada com pasta fresca de levedura e deixe-as depositar ovos por 24 horas.
   2. Reúna as larvas recém-eclodidas do primeiro estágio na placa de ágar de suco de uva e transfira-as para um pequeno frasco (12 mL) contendo 2-3 g de pasta alimentar para moscas (comida para moscas misturada com a quantidade adequada de água). 20 a 30 larvas são colocadas no frasco. As larvas de mosca são deixadas crescer a 25 °C.
2. No momento apropriado, prepare uma placa de Petri de 4 cm contendo uma camada fina e uniformemente distribuída de pasta alimentar para moscas, cobrindo uma área de aproximadamente 1,5-2,0 cm de diâmetro (doravante chamada de arena de ensaio de infecção). Além da arena do ensaio de infecção, prepare um novo frasco pequeno (12 mL) contendo a quantidade adequada de pasta alimentar para moscas. Este frasco é usado para criar as larvas hospedeiras após o ensaio de infecção.
3. Colete larvas em fases e transfira-as para um recipiente contendo água desionizada (resistividade = 15 MΩ·cm, 25 °C). Enxágue as larvas no recipiente com uma agitação suave para remover o alimento residual do corpo.
4. Após o enxágue, remova suavemente o excesso de umidade das larvas usando lenços de papel sem fiapos, pois o excesso de água interfere no comportamento de oviposição da vespa na área do ensaio de infecção. Depois, transfira as larvas para a arena. Essa etapa aumenta a atividade larvaria durante o experimento de infecção.
5. Anestesiar vespas adultas com gás CO₂ a uma vazão de 5 L·^min-1 e pressão de 0,2 MPa. Em seguida, coloque delicadamente aproximadamente três vespas fêmeas na área de ensaio de infecção. Feche a tampa do prato e deixe que eles se recuperem na pasta alimentar para moscas.
6. Observe o comportamento de oviposição dessas vespas sob um estereoscópio (ajuste de zoom: 10× a 15×).
   NOTA: Quando uma vespa toca o corpo larval de uma mosca em movimento, ela rapidamente insere seu ovipositor no corpo da mosca e injeta componentes do veneno. Embora a larva de mosca se contorça e agite o corpo, ela imediatamente fica paralisada. Subsequentemente, a vespa vibra seu abdômen e deposita um ovo no corpo larval hospedeiro, após o que o ovipositor é retirado. Esse comportamento de oviposição é chamado de infecção.
7. Após a infecção, abra a tampa e transfira a larva infectada para o novo pequeno frasco contendo pasta alimentar preparada no Passo 3.2. Para padronizar o momento da infecção, realize o experimento de infecção em até 15 minutos.
8. Rotule o pequeno frasco com informações experimentais, como data, nome da amostra, tempo de infecção e número de indivíduos. Esses frascos são tapados e depois colocados em um recipiente úmido e mantidos a 25 °C.

4. Geração de vespas de interferência de RNA (RNAi) por injeção de dsRNA

1. Sintetize dsRNAs de 400 bp ou mais para knockdown gênico mediado por dsRNA (interferência de RNA, RNAi) usando um sistema de síntese de dsRNA baseado em transcrição in vitro . As amostras de dsRNA devem ser mantidas entre -20 e -80 °C até o uso. Os protocolos detalhados são os descritos anteriormente⁹.
2. Prepare uma placa de Petri de 5,5 cm contendo 2% de ágar para posicionar corpos de vespas. Preencha dois terços de cada recipiente com ágar para criar uma camada espessa de placa de ágar para injeção.
3. Coloque um lenço de papel sem fiapos umedecido com água sobre a tampa de uma panela plástica.
4. Recolha as pupas da mosca hospedeira 7 dias após a infecção (dpi) do frasco e coloque-as sobre os lenços de papel sem fiapos preparados no Passo 4.3. Adicionar uma gota de água à parede do frasco ajuda a desprender as cápsulas das pupas da mosca do hospedeiro do frasco.
5. Sob o estereomicroscópio (ajuste de zoom: 20×), remova a pupa da mosca hospedeira e exponha o corpo da vespa com pinças. A 7 dpi, a maioria das vespas está no estágio pupal, no qual as partes da cabeça, tórax e abdômen são distinguíveis. O corpo de uma vespa é imóvel.
6. Coloque os corpos das vespas recuperadas sobre a placa de ágar preparada no Passo 4.2, alinhando seus eixos corporais na mesma orientação. Organize 20-30 corpos de vespas com o lado dorsal para cima em uma a duas linhas. Remova o excesso de umidade da placa de ágar usando um lenço de papel sem fiapos para evitar que as vespas escorreguem.
7. Seguindo as instruções do fabricante, instale o aparelho de injeção e o estereoscópio (Figura 3A). Use um sistema de microinjeção equipado com uma agulha capilar de vidro que permite controle preciso do volume e da velocidade da injeção. Coloque a placa de ágar em que as cabeças da vespa estejam orientadas em direção à ponta da agulha de injeção. O volume de injeção é de 50 nL·^wasp-1 e a velocidade de injeção é de 50 nL·^seg-1 no injetor.
8. Prepare agulhas capilares de vidro usando um puxador de agulhas. A forma do capilar de vidro é ajustável com a temperatura do aquecedor.
9. Coloque a agulha capilar de vidro sobre o moedor de agulhas em um ângulo de 30-35°. Moa a agulha até que o comprimento da ponta atinja 0,04 mm (quatro divisões na retícula ocular, Figura 3B).
10. Pouco antes da injeção, descongele o dsRNA. A concentração de dsRNA é de 0,25-1 μg·^μL-1. Para visualização, a solução de dsRNA é colorida com um corante azul (sal diassódico Erioglaucina, 2% peso·^volume-1). Usando uma ponta de microloader pipeta, preencha o capilar de vidro com solução de dsRNA com corante azul. 4 μL são suficientes para injetar 30 corpos de vespas. Certifique-se de que não haja bolhas de ar dentro da solução.
    NOTA: Após carregar a solução de dsRNA, toque suavemente a lateral da agulha com uma unha para remover quaisquer bolhas de ar presas. Bolhas residuais de ar podem obstruir o fluxo da solução e interferir na injeção bem-sucedida.
11. Usando uma seringa de 1 mL e uma agulha, preencha a parte livre do capilar de vidro com óleo mineral, garantindo que não restem bolhas de ar dentro do capilar.
12. Prenda a agulha capilar de vidro contendo a solução de dsRNA e óleo mineral no suporte da agulha e depois a fixe no dispositivo de injeção.
13. Ajuste a posição da placa de ágar e da agulha capilar de vidro no injetor, de modo que a agulha de vidro fique posicionada em um ângulo de 30-45° em relação aos corpos das vespas (Figura 3A).
14. Insira a agulha capilar de vidro no lado dorsal do corpo da vespa, com o lado levemente lateral em relação à linha média dorsal. Microinjete a solução de dsRNA dentro do corpo. A solução de dsRNA injetada é visível com o corante  azul (Figura 3C).
15. Após a injeção, coloque as placas de ágar em um recipiente úmido (70-80% de umidade relativa) e mantenha-as em uma incubadora a 25 °C por uma semana, até que as vespas adultas nascam. Corpos de vespas feridas devem ser removidos da placa de ágar para evitar contaminação bacteriana.
    PONTO DE PAUSA: No Passo 4.6, as pupas da vespa podem ser mantidas na placa de ágar por várias horas antes da injeção. Agulhas podem ser preparadas com antecedência (Passos 4.8 e 4.9); porém, eles tendem a entupir com o tempo. Agulhas recém-preparadas geralmente proporcionam um desempenho de injeção mais confiável.

Resultados

As linhagens assexuadas e sexuais de Asobara japonica
A. japonica está amplamente distribuída por todo o Japão. Cepas partenogenéticas Thelytokous predominam nas ilhas principais, enquanto cepas sexuais arrhenotokous são encontradas nas ilhas subtropicais, incluindo as ilhas Amami-Oshima e Iriomote-jima ^8,12. Nas linhagens sexuais, os machos emergem alguns dias antes que as fêmeas, de modo q...

Discussão

Neste estudo, estabelecemos uma plataforma experimental versátil para investigar as interações parasitoides-hospedeiros em nível molecular. Ao otimizar as condições de criação, um ensaio de infecção por oviposição única e o protocolo RNAi, fornecemos um sistema robusto para estudos funcionais de fatores derivados de parasitoides. Esta plataforma facilitará estudos futuros voltados a descobrir os mecanismos pelos quais vespas parasitoides manipulam o desenvolvimento do hospedeiro e também...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
50 mL tube	Greiner Bio-One	210261	Infection assay
1 mL syringe	TERUMO	SS-01T	dsRNA injection
Agar	Daisin, Ltd.	P-700	Rearing
Asnol Petri Dish φ40×13.5mm	As One Corporation	1-8549-01	Infection assay
Asnol Petri Dish φ55×17mm	As One Corporation	1-8549-02	dsRNA injection
Blue dye (Erioglaucine disodium salt)	Sigma-Aldrich Co. Llc.	861146-25G	dsRNA injection
Butyl p-Hydroxybenzoate	Nacalai Tesque, Inc.	06327-15	Rearing
CO2 pressure regulator	YAMATOSANGYO	YR-507F-2	Infection assay
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	LSM700	Image analysis
Corn meal	Sunny Maize Co., Ltd.	No.4M	Rearing
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	PI62247	Nuclei staining, 1:10000
Deionized water	Millipore Inc.	ZLXEV030WW	Infection assay
Dual-Stage Glass Micropipette Puller	Narishige	PC-10	dsRNA injection
Fiji	NA	https://fiji.sc	Image analysis
Filter paper	Advantec	ITEM 526	Rearing
Fly food vial	Chiyoda Science Co., Ltd.	KFB-3M	Rearing
Fly food vial plug	Chiyoda Science Co., Ltd.	AS-275	Rearing
Forceps	Dumont Biologie	11252-20	Dissection
Freezer, -20 °C	Nihon Freezer	GS-3120HC	Sample storage
Freezer, -80 °C	Nihon Freezer	CLN-52UD2	Sample storage
Glass slides	Matsunami Glass Ind., Ltd	S7213	Infection assay
Glucose	Showa Sangyo Co., Ltd.	Not availavle	Rearing
KOD Plus Neo	Toyobo	KOD-401	dsRNA synthesis
Incubator	Panasonic	MIR-254-PJ	Rearing
Ligation high Ver.2	Toyobo	LGK-201	dsRNA synthesis
Micropipette Grinder	Narishige	EG-401	dsRNA injection
Mineral oil	Nacalai Tesque, Inc.	23306-84	dsRNA injection
Nanoject III	Drummond Scientific Company	3-000-207	dsRNA injection
Nanoject Glass Capillaries	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	dsRNA injection
pBluescript KS (+) plasmid	Not availavle	Not availavle	dsRNA synthesis
pBluescript SK (-) plasmid	Not availavle	Not availavle	dsRNA synthesis
PrimeScript reverse Transcriptase	Takara	2680A	dsRNA synthesis
Propionic acid	Nacalai Tesque, Inc.	29018-55	Rearing
PROWIPE	Daio Paper Corporation	2-2624-02	Infection assay, dsRNA injection.
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover	Toyobo	FSQ-301	qRT-PCR
RNAiso Plus reagent	Takara	9108	qRT-PCR
Small vial (Test tube 12 mL)	Sarstedt	REF 58.487	Infection assay
Small vial plug	Chiyoda Science Co., ltd.	QD-S4	Infection assay
Spatula	As One Corporation	6-522-02	Rearing
Square petri dish	Eiken Chemical Co., Ltd.	64-2192-55, AW2000	dsRNA injection
Stereomicroscope	Leica Microsystems	lvesta3 (C-Mount)	Infection assay
Stereomicroscope	Nikon Solutions Co., Ltd.	SMZ1000	dsRNA injection
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	dsRNA synthesis
Thermal Cycler Dice Real Time System	Takara	TP815	qRT-PCR
Thermal Cycler GeneAtlas	Astel	G02	dsRNA synthesis, qRT-PCR
THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix	Toyobo	QPS-201	qRT-PCR
TissueLyser II	Qiagen	Not availavle	qRT-PCR
Vitamin C, L-Ascorbic Acid	Nacalai Tesque, Inc.	03420-65	Rearing
Welch's grape 100 juice	Asahi Soft drinks Co., Ltd.	32390	Infection assay
Yeast	Asahi Group Foods, Ltd.	HB-P02	Rearing