Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em meios sólidos

Para medir a longevidade em C. elegans, uma população sincronizada por idade é gerada por meio de uma postura de ovos controlada no tempo. Vermes hermafroditas adultos ativos são transferidos para placas de meio de crescimento de nematoides inoculadas com E. coli morta por UV, onde permanecem por seis a oito horas para postura de ovos e, em seguida, são removidos. Nos dois dias seguintes, vermes eclodem desses ovos e crescem até o estágio larval L4. Os vermes L4 são transferidos para novas placas de NGM contendo ampicilina para prevenir contaminação bacteriana viva e FUDR para impedir a reprodução, sendo então deixados desenvolverem-se até a fase adulta.

A partir deste momento, os vermes adultos são observados a cada dois ou três dias até que todos os vermes tenham morrido. Em cada ponto temporal, os vermes mortos são removidos da placa e o número de vermes vivos e mortos é registrado. Eu sou George Seton do laboratório de Matt Capline do Departamento de Patologia da Universidade de Washington.

Hoje vamos mostrar como medir a longevidade e observar a nossa elegância em hepatite. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a genética do envelhecimento. Então, vamos começar.

Um experimento básico de longevidade requer dois tipos de placas: placas NGM padrão, que não contêm aditivos, e placas AMP FUDR, que possuem ampicilina e fluordesoxiuridina adicionadas ao NGM. Ambos os tipos de placas são semeados com bactérias e coli OP50, que posteriormente são inativadas pela exposição à radiação ultravioleta. Comece preparando 10 mililitros de solução NGM.

Para cada placa de Petri de 60 milímetros, derreta completamente o NGM sólido aquecendo-o no micro-ondas em pulsos de 32 segundos na potência máxima. Agite o meio entre os pulsos para evitar o acúmulo de bolhas de gás pressurizado. Coloque o NGM líquido em banho-maria a 55 graus Celsius ou sobre a bancada para permitir que o meio esfrie. Uma vez que o meio tenha atingido 55 graus Celsius, temperatura na qual você deve conseguir segurar o recipiente de vidro com as mãos nuas confortavelmente, ele estará pronto para receber os fármacos.

E para preparar as placas com drogas, adicione 33 microlitros de FUDR 150 milimolar e 100 microlitros de ampicilina a 100 miligramas por mililitro por 100 mililitros de NGM e agite suavemente para misturar. A ampicilina é utilizada para prevenir contaminação bacteriana estranha e o FUDR para impedir a eclosão dos ovos. Assim, os vermes não precisarão ser transferidos a cada poucos dias para separá-los das larvas em desenvolvimento.

Agora, despeje o meio e deixe as placas secarem sobre a bancada por dois dias. No dia anterior à conclusão da secagem das placas, inicie um cultivo líquido de LB com uma colônia isolada de um streak fresco de e coli. Bactérias OP 50 em ágar LB. Prepare pelo menos 0,5 mililitro de cultivo por placa de 60 milímetros.

Coloque o cultivo OP 50 em um agitador a 37 graus Celsius e deixe as bactérias crescerem durante a noite. No dia seguinte, pelletize as bactérias OP 50 com uma força centrífuga de 3.500 ×g por 10 minutos. Decante parte do sobrenadante suficiente para ressuspender as bactérias em uma concentração 10×.

Agora, inocule cada placa com 100 microlitros da cultura concentrada. Evite tocar a ponteira da pipeta na superfície do NGM, pois imperfeições na superfície do meio permitirão que os vermes se enterrem; gire as placas até que as bactérias cubram a área central do NGM sem se aproximar das paredes da placa e deixe as placas secarem sobre a bancada por 24 horas. Após a secagem, exponha a superfície das placas a uma dose de UV suficientemente forte para interromper o crescimento bacteriano; utilizamos um crosslinker de UV Strata Gene 2400.

Inicie carregando as placas no conector tipo garfo sem as tampas. Agora pressione energia. Digite 9 9 9 9 no teclado numérico e pressione iniciar.

As placas serão expostas à radiação UV por aproximadamente cinco minutos. As placas com bactérias mortas por UV podem ser armazenadas de cabeça para baixo a quatro graus Celsius por até um mês. Esta seção descreve como gerar uma população de vermes com uma data de eclosão comum.

Inicie transferindo aproximadamente 20 vermes adultos jovens para uma placa NGM fresca sem drogas. Deixe a placa a 25 graus Celsius por cerca de uma semana para permitir que os vermes se multipliquem e consumam todo o alimento bacteriano em uma semana. Vermes recém-eclodidos no estágio de repouso em forma de doura devem aparecer; transfira 20 a 30 larvas em estágio de doura para uma placa NGM fresca sem drogas e incube-os a 25 graus Celsius na presença de alimento.

As larvas recém-nascidas se tornarão adultos reprodutivamente ativos em até dois dias e permanecerão reprodutivamente ativos por alguns dias após esse período. Agora, transfira de 10 a 15 adultos reprodutivamente ativos para uma placa fresca de NGM sem drogas. Essa placa é denominada placa de postura de ovos em tempo determinado ou placa TEL.

Deixe a placa TEL a 25 graus Celsius para que os vermes possam pôr ovos. Os animais que eclodirem desses ovos serão os animais experimentais e terão sua longevidade avaliada após seis horas. Inspecione a placa TEL em busca de ovos.

Se ainda não houver ovos suficientes, deixe a placa TEL a 25 graus Celsius por até um total de 24 horas, verificando periodicamente a presença de ovos. Quando um número suficiente de ovos tiver sido depositado, remova os adultos da placa TEL.

Um experimento típico de longevidade exigirá de 30 a 90 ovos por grupo experimental, mas várias centenas de ovos podem ser geradas em uma única placa TEL. Aproximadamente 150 ovos serão postos por 10 a 15 adultos reprodutivamente ativos em seis a oito horas. Ao comparar grupos experimentais, a significância estatística pode ser alcançada para grandes diferenças de longevidade com apenas 30 animais.

Devem ser utilizados mais animais para distinguir diferenças mais modestas. Agora, coloque a placa TEL sem adultos a 20 graus Celsius até que os ovos eclodam e os vermes tenham se desenvolvido até o estágio larval L4. Isso geralmente leva dois dias para o tipo selvagem C. elegans, mas pode levar mais tempo para linhagens com fenótipos de desenvolvimento lento.

Esta seção descreve como acompanhar o ciclo de vida de uma população sincronizada por idade. Primeiro, transfira as larvas L4 do prato TEL para pratos AMP FUDR dispostos em posição horizontal. Para cada linhagem ou condição testada, é comum preparar duas a três placas com 25 a 30 vermes por placa.

Incube as placas AMP FUDR a 20 graus Celsius por 24 horas. Em seguida, avalie visualmente os vermes, o meio e a bactéria; transfira os vermes para placas AMP FUDR frescas. Se os vermes tiverem consumido a maior parte do alimento bacteriano, isso geralmente ocorrerá uma ou duas vezes por semana.

No início do experimento, se um número significativo de larvas estiver presente, isso geralmente indica que os vermes foram transferidos para as placas com AMP FUDR como adultos jovens em vez de como L4. Adultos jovens podem pôr ovos antes que o FUDR faça efeito, e ocasionalmente as larvas escapam dos efeitos do FUDR e se desenvolvem em adultos. Essas larvas irão confundir o experimento nesta situação; transfira os vermes adultos para placas frescas e descarte as placas antigas contendo as larvas.

Os vermes também devem ser transferidos para placas frescas caso sejam observadas bactérias vivas em crescimento. Geralmente, a combinação de AMP e inativação por UV garante que nenhuma bactéria viva contamine o experimento, mas ocasionalmente isso pode ocorrer. Além disso, transfira os vermes.

Se o crescimento fúngico for observado no meio. Se detectado precocemente, o fungo pode ser removido usando a ponta de uma pipeta ou uma espátula. Uma vez que cresça até atingir um diâmetro maior que alguns milímetros, geralmente é mais fácil transferir os vermes para uma nova placa.

Avalie a longevidade de todos os vermes a cada dois ou três dias. Utilizando um microscópio estereoscópico, determine se cada verme está vivo ou morto.

Toque suavemente na placa. O verme está vivo se se mover em resposta à batida. Se o verme não responder ao toque na placa, aumente o zoom na região da cabeça e toque suavemente na cabeça do verme com uma alça de platina.

Classifique o verme como morto. Se ele não responder movendo a cabeça, remova o verme morto da placa. Após verificar todos os vermes, registre a data e o número de vermes vivos e mortos.

Vermezinhos mantidos em meio sólido ocasionalmente escapam da superfície da placa ao se enterrarem ou rastejarem pela parede. Os vermezinhos que fogem são completamente omitidos do estudo. Ao finalizar, devolva as placas ao incubador a 20 graus Celsius.

Aguarde mais dois a três dias e, em seguida, verifique novamente as placas. Continue esse regime até que todos os vermes tenham morrido. O número de vermes que morrem a cada dia é normalmente invertido para calcular a proporção de vermes vivos em cada dia; esses dados são representados graficamente como uma curva de sobrevivência, considerando-se o dia da postura programada dos ovos.

Dia zero. A longevidade mediana típica para N dois. A linhagem selvagem de C. elegans mantida em bactérias mortas por UV a 20 graus Celsius é de aproximadamente 25 dias, medida a partir do ovo.

Acabamos de mostrar como medir a longevidade e observar a elegância. Você pode modificar este procedimento básico para testar uma variedade de condições ambientais, incluindo restrição dietética e interferência por RNA, o que é discutido no texto complementar. Assim sendo, é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.