Identificação de complexos de proteínas com proteômica quantitativa em S. cerevisiae

Este procedimento inicia com o cultivo da cepa isca em meio contendo aminoácidos normais na cepa controle SLAC e lisina e arginina com isótopos pesados. Quantidades iguais de ambas as cepas são misturadas e lisadas por meio de trituração com nitrogênio líquido. Os lisados brutos são primeiramente peletizados por centrifugação e depois clarificados pela ligação a esferas de acrílico. O lisado celular é então ligado a esferas de IgG.

As proteínas ligadas às microesferas de IgG são eluídas por clivagem com protease e precipitadas. A amostra está agora pronta para análise por espectrometria de massas. Olá, sou Jesse Chao do Laboratório Lone, do Departamento de Biologia Celular e Ambiental, no Instituto de Ciências da Vida da Universidade da Colúmbia Britânica.

Hoje apresentamos um procedimento para análise proteômica quantitativa chamado silak, combinado com purificação por afinidade. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar complexos proteicos.

Então vamos começar. Neste procedimento, a linhagem isca contém aminoácidos normais, enquanto a linhagem controle SLAC contém lisina e arginina com isótopos pesados. Para começar, cultive inicialmente um litro de cada linhagem — a linhagem isca e a linhagem controle — separadamente, até o valor indicado na sua tela. Em seguida, despeje o cultivo em tubos de centrífuga Nalgene de 500 mililitros.

Equilibre a carga nas células do pellet a 2.580 RCF, decante o meio e re-suspenda o pellet com 50 mililitros de água destilada fria (D H2O). Durante a transferência das células para tubos de centrífuga de 50 mililitros, centrifugue os tubos para obter o pellet celular a 3.000 RCF. Neste ponto, você pode congelar o pellet a -80 graus Celsius.

É importante lembrar de parear a cultura da cepa controle com a cultura da cepa isca, em uma proporção de um para um, com base no peso seco do pellet. Re-suspenda cada pellet celular em 10 mililitros de tampão NP-40 contendo um coquetel de inibidores de protease na proporção de um para 2000. Misture as duas culturas celulares vertendo diretamente um tubo no outro.

Para começar a moer as células, despeje primeiro o nitrogênio líquido no almofariz previamente resfriado e deixe-o evaporar completamente. Em seguida, adicione dois mililitros de células ao almofariz. Despeje um pouco de nitrogênio líquido para congelar as células.

Triture as células até que fiquem em pó fino. Repita o processo até que todas as células sejam trituradas. Certifique-se de não permitir que as células descongelem.

Adicione nitrogênio líquido quando necessário. Em seguida, transfira o pó para um béquer gelado e descongele à temperatura ambiente. Quando as bordas começarem a descongelar, adicione 20 mililitros de tampão NP-40 com PIC na proporção de 1:200 após o descongelamento.

Transfira o lisado bruto para tubos Nalgene de 40 mililitros e centrifugue a 16.000 RPM em um rotor Sovos SA 600 por 30 minutos. Enquanto isso, retire 300 microlitros das microesferas SROs two B e lave as microesferas três vezes com 300 microlitros de tampão NP-40. Em seguida, re-suspenda as microesferas em 300 microlitros de tampão, de modo que fiquem em uma suspensão na proporção de um para um.

O próximo passo é pré-limpar o lisado celular. Para isso, primeiramente transfira o sobrenadante para um novo tubo e adicione as esferas de B. Incube em uma plataforma rotativa em câmara fria por 30 minutos.

Enquanto incuba, retire 300 microlitros de SROs de IgG com seis esferas e lave as esferas três vezes em 300 microlitros de tampão NP-40. Em seguida, re-suspenda as esferas em 300 microlitros de tampão, de modo que fiquem em uma suspensão na proporção de um para um. Após a incubação, pelote os SROs.

Duas contas em. Transfira o sobrenadante para um novo tubo. Lembre-se de guardar uma alíquota do lisado celular para o western blot posteriormente.

Em seguida, adicione as microesferas de IgG. Separe o conteúdo em dois tubos para uma ligação mais eficiente, incube em uma plataforma rotativa em câmara fria por duas horas. Após a incubação, colete as microesferas em uma coluna de cromatografia a quatro graus Celsius.

Certifique-se de guardar uma alíquota da fração não ligada. Lave as perlas com 10 mililitros de tampão NP-40.

Em seguida, lave as esferas com três mililitros de tampão TEVC. Novamente, lembre-se de reservar uma alíquota das esferas.

Isso refletirá a eficiência da ligação para eluir as esferas. Primeiro, adicione cinco microlitros de A-C-T-E-V a um mililitro de tampão TEVC. Adicione o tampão TEVC às esferas e misture.

Transfira o conteúdo para dois tubos EINOR de 1,5 mililitro para uma mistura mais eficiente e incube em uma plataforma rotatória em câmara fria durante a noite. Em seguida, centrifugue os grânulos e transfira o eluato para um tubo fresco de 1,5 mililitro. Lave os grânulos com 0,5 mililitro adicional de tampão TEVC após a lavagem.

Combine os oito em um único tubo. Você deve ter 1,5 mililitro de ELU oito no total. Guarde uma alíquota do TEV Elu oito para precipitação.

Ajuste as alíquotas para TCA 25% com TCA a cem por cento. Para fazer isso, separe o LU oito de 1,5 mililitro em dois tubos de 750 microlitros cada. Adicione 250 microlitros de TCA 100% ao tubo.

A sua solução deve ficar turva. Em seguida, coloque-a no gelo por 30 minutos. Vortexe periodicamente a mistura após a incubação.

Centrifugar em velocidade máxima na centrífuga de bancada em câmara fria por 30 minutos. Lavar uma vez com 500 microlitros de acetona gelada contendo ácido clorídrico 0,05 normal. Em seguida, centrifugar por cinco minutos em velocidade máxima a quatro graus Celsius.

Em seguida, lave uma vez com 500 microlitros de acetona gelada e centrifugue por cinco minutos em velocidade máxima a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova cuidadosamente a acetona e seque o pellet para coloração com prata. Reconstitua o pellet em 50 microlitros de tampão amostral SDS na concentração de uma vez.

Se você planeja utilizar a proteína precipitada para análise baseada em espectrometria de massa, recomenda-se realizar a precipitação usando etanol. Para isso, primeiramente, adicione 20 microgramas de glicogênio, em seguida dilua as amostras cinco vezes com etanol a cem por cento e ajuste para 50 milimolares de bicarbonato de sódio com uma solução estoque 2,5 molares em pH 5,0. Misture a solução invertendo o tubo.

Deixe repousar por duas horas à temperatura ambiente. Por fim, divida o conteúdo em dois tubos eppendorf. Peliculize a proteína precipitada por centrifugação durante 10 minutos a 12.000 ×g à temperatura ambiente.

O alíquota salva durante o procedimento de purificação deve incluir o lisado celular pré-limpo, a fração ligada, a fração não ligada e a fração eluída. Recomendamos analisar o conteúdo proteico das alíquotas acima por meio de Western blot usando anticorpo Antit TAP ou coloração com prata para refletir a eficiência de ligação e eluição do experimento. Neste gel corado com prata, a SCS purificada com duas alças TAP em suas proteínas interagentes foi visualizada e comparada a um controle sem marcação nesta análise de Western blot.

Várias frações obtidas durante a purificação da SCS two tap foram analisadas por meio de Western blotting utilizando o anticorpo Anti-tap. Observe que a SCS two tap migrou com um peso molecular menor após a eluição pela clivagem com a protease TEV, e não restou nenhuma SCS two tap nos grânulos de IgG após a eluição. Isso confirmou que a purificação foi altamente eficiente.

Acabamos de mostrar como purificar complexos proteicos por purificação por afinidade com microesferas de IgG. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de assegurar o pareamento da cepa base e da cepa controle pelo peso do pellet seco antes de iniciar o procedimento de purificação. Como o LAC nos fornece medições imparciais e isentas de viés dos parceiros de ligação proteica, realizamos apenas a primeira etapa da purificação TAP para minimizar a perda de amostra.

Se você observar quantidades significativas de ligação inespecífica, talvez deseje realizar todo o protocolo, que pode ser encontrado no manual do cold springing harbor. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

Ei, vamos lá, mark. Ah, vai.