Focal Ca ^{2 +} Detecção de transitórios no músculo liso

Primeiro, uma solução de carregamento de cálcio é preparada, aquecida e borbulhada. A bexiga urinária é dissecada, aberta, fixada em posição plana e uma tira de detrusor é retirada. A tira de detrusor é adicionada à solução de carregamento, incubada e lavada, depois fixada em posição plana.

O nível de cálcio quatro no interior do tecido é excitado por luz laser e a luz emitida resultante é capturada. Filmes compostos por quadros individuais são analisados mediante comparação de quadros sucessivos. O fundo é subtraído.

O limiar da borda celular determina onde os eventos podem ser encontrados e é feita uma razão entre cérebros sucessivos. Se os eventos restantes corresponderem a critérios predefinidos, eles são destacados e rotulados. Olá, meu nome é John Young dos laboratórios de Keith Brain e Tom Kinane no Departamento de Farmacologia, Universidade de Oxford.

Sou Rob Amos, também dos laboratórios Brain e Canne, e meu nome é Keith Brain. Hoje, John e Rob mostrarão uma técnica de imagem de cálcio em músculo liso. Utilizamos esta técnica em nosso laboratório para estudar a liberação de neurotransmissores a partir de nervos autônomos e seu efeito sobre o músculo liso.

Então vamos começar. O indicador de cálcio organ green, 4 88 BAFTA 1:00 AM é fornecido em frascos de 500 microlitros contendo 50 microgramas de pó. Para preparar o indicador de cálcio, adicione 40 microlitros de solução Onic F1 27 ao pó e agite suavemente por 30 segundos; em seguida, adicione 460 microlitros de solução salina fisiológica (PSS) e agite suavemente por mais 30 segundos.

A solução final, 10 micromolares de organ green. 4 88 BAFTA 1:00 AM fornece quatro alíquotas de 125 microlitros cada. Evite a exposição à luz e armazene a solução a menos 20 graus Celsius antes de dissecar o tecido de interesse.

Retire o indicador de cálcio do congelador e deixe descongelar em temperatura ambiente enquanto o indicador de cálcio estiver fino. Coloque um mililitro de PSS em um tubo de ensaio e em um banho-maria a 33 graus Celsius. Prenda um borbulhador no tubo de ensaio com uma rolha, ou você também pode usar perfil e, em seguida, borbulhe com uma mistura de 95%oxigênio e 5%dióxido de carbono a uma taxa de aproximadamente uma bolha por segundo.

Disseque o órgão de músculo liso do animal. Neste caso, é a bexiga urinária de um camundongo. Coloque o órgão em cerca de 50 milímetros de PSS para lavá-lo; após a lavagem cuidadosa do tecido, remova o tecido adiposo ciero e o tecido conjuntivo.

Disseque abrindo de acordo com o tipo laureano de músculo liso para a bexiga urinária. Abra longitudinalmente desde o colo da bexiga, da extremidade caudal até o topo da cúpula. Na extremidade cranial, prepare quatro tiras, com seis a oito milímetros de comprimento e um a dois milímetros de largura, ao longo da superfície dorsal do resser, cortando na direção dos feixes musculares predominantes.

Coloque o tecido dissecado e a PSS pré-aquecida e borbulhada para carregar o indicador de cálcio com 125 microlitros de organ green 10 micromolar, 4 88 B às 1:00 da manhã no tecido no tubo de ensaio e agite levemente à mão para misturar. Devolva o tubo ao banho-maria. Retome a borbulhação e cubra o banho-maria com uma folha de papel alumínio.

O tempo necessário para que o tecido absorva uma quantidade suficiente do indicador de cálcio varia conforme o tamanho do tecido e a espessura da camada muscular lisa. Por exemplo, para o detrusor de camundongo e oxs de rato, são 70 minutos. Já para o detrusor de rato e VAs deens de camundongo, incubamos por 120 minutos.

Uma vez que o tecido tenha sido carregado com o indicador de cálcio, ele pode ser preparado para microscopia. Primeiro, lave o tecido em PSS borbulhado por 10 minutos. Em seguida, monte o tecido em um recipiente de preparação forrado com grade S.

Estique levemente para formar uma lâmina plana. Prenda o tecido usando pequenos comprimentos, por exemplo, dois milímetros de fio de prata com diâmetro de 25 a 50 micrômetros, e insira os pinos em um ângulo.

Evite usar pinos com mais de alguns milímetros de comprimento, pois eles podem arranhar a objetiva. O posicionamento cuidadoso dos pinos no tecido é importante para minimizar movimentos espontâneos do tecido e facilitar a localização de um local apropriado para a aquisição de imagens. Após o tecido ter sido fixado com pinos, posicione o recipiente de preparação na platina do microscópio.

Atenção para que o PSS não escape da área forrada com sil guard da placa. Isso pode fazer com que uma grande área seja coberta por PSS. Quando a superfusão começar para fins de demonstração, os seguintes passos serão realizados sob luz visível.

Observe que esses experimentos normalmente são realizados no escuro. Ligue a bomba para superperfundir o preparo. Com PSS, uma taxa de 100 mililitros por hora é frequentemente utilizada.

Ligue a unidade de aquecimento, coloque os tubos de entrada e saída e a sonda de temperatura sobre o prato de preparação, fixando cada um à tira metálica por meio do ímã em sua base. A altura da extremidade do tubo de saída determinará a profundidade da PSS. Tenha cuidado para garantir que o fluxo de saída esteja realmente removendo a PSS, pois às vezes isso não ocorre.

Defina inicialmente a temperatura na unidade de aquecimento para atingir a temperatura desejada entre 33 e 35 graus Celsius. Deixe o tecido equilibrar por pelo menos 10 minutos com uma objetiva de baixa potência. 10 ou 20 vezes.

Utilize fluorescência epi ou excite com luz azul para visualizar o músculo liso e identificar uma região adequada para monitoramento. Como a exposição à iluminação de excitação provocará fotobranqueamento do indicador, evite usá-la por mais de alguns segundos por vez.

Evite áreas com estruturas brilhantes, pois elas podem causar um alto número de falsos positivos no algoritmo de detecção de imagem. Tente escolher um local com movimento mínimo e um grande número de células musculares lisas no campo. Após selecionar o local para imagem, mude para uma objetiva de maior aumento, como a de 40 x.

Gire o estágio ou o eixo óptico para que a célula ou as células musculares lisas fiquem na posição horizontal, ou seja, paralelas ao eixo de varredura rápida. As células musculares lisas estão agora prontas para serem imagiadas por microscopia confocal.

Neste protocolo, utilizamos um microscópio confocal ereto Leica SP dois. Feche o diafragma até um disco airy. Ajuste a potência do laser entre 25 e 35% no filtro óptico personalizável.

Esse valor representa um compromisso entre brilho e fotodesvanecimento. Para preparar a análise de dados, baixe e instale o ImageJ. Baixe a versão específica para sua plataforma e, em seguida, atualize para a versão mais recente baixando o arquivo jar mais recente do ImageJ para substituir o arquivo antigo. Em seguida, baixe o arquivo jar do Excel Writer e instale-o no diretório de plugins jar.

Copie esses arquivos no diretório de plugins. Instale cada um desses scripts usando as macros de plugins. Instale a função do ImageJ. O software para o microscópio confocal Leica SP2 que utilizamos chamado Leica.

O LCS salva quadros individuais de cada série como arquivos separados. Para reconstruir a série, certifique-se de que todos os quadros a serem reconstruídos estejam em uma única pasta.

Por exemplo, pasta de dados tiffs. Em seguida, selecione o macro Leica SP two stacker no menu plugins macros. Selecione o diretório raiz, neste caso a pasta de dados.

Selecione a pasta desejada na lista suspensa. Neste caso, tiffs selecione um diretório de saída ou gere um novo. Por exemplo, pastas de dados em pilha.

O script então reconstruirá a série a partir de quadros individuais para corrigir o movimento. Utilizamos um algoritmo de acesso livre que alinha ou combina quadros dentro de uma pilha de séries baixadas, rig e turbo reg. Copie os arquivos de cada um para a pasta stacks.

Carregue uma pilha a ser processada e, em seguida, vá para um quadro que mostre claramente o campo de interesse. Os demais quadros serão alinhados a esse quadro de referência. Depois disso, vá para plugins pilhas.

Aplicar Reg. de Empilhamento. Testar cada uma das diferentes transformações para determinar qual é a mais eficaz para cada local. Os fatores de imagem que afetam a detecção de transientes de cálcio variarão conforme a medição de certas propriedades, parâmetros de partículas de cada local.

A sensibilidade e a especificidade da detecção são aumentadas. Assim, para cada local, calcularemos o limiar subtraído do limiar da razão e o limiar da borda celular. Para começar, vá até plugins, macros, instale e selecione jn CTO dot oh eight release dot IJM JM. Em seguida, vá até plugins macros carregar pilha.

Selecione uma série e calcule os seguintes parâmetros das partículas. Para calcular o limiar para subtração, selecione uma região retangular de interesse sobre o que você considera ser a medida de fundo. Anote a média. Para calcular o limiar para a razão, selecione uma região retangular de interesse ao redor de uma área opticamente plana da célula ou das células musculares lisas.

Meça a nota e anote a média e o desvio padrão. Repita o processo mais duas vezes, ou você pode desenhar três caixas de uma vez pressionando shift. Calcule e anote o limiar para a razão.

Calcule como o desvio padrão dividido pela média, some um e então multiplique o resultado por 32. Fazendo a média dos valores das três réplicas, o fator 32 é necessário para levar em conta o algoritmo de razão, no qual nenhuma alteração em relação ao quadro anterior é mapeada para um valor inteiro de 32. Isso fornece uma boa faixa dinâmica para detectar aumentos e diminuições na razão.

Para uma imagem de oito bits, selecione ajuste de imagem e limite. Selecione preto e branco. Defina abaixo do limite deslizante superior e anote o valor correspondente.

Isso está à direita do controle deslizante. Apenas eventos que ocorrem nas regiões pretas serão contabilizados. Clique em redefinir.

Agora que o limiar subtraído para a razão e o limiar da borda da célula foram calculados, podemos analisar as pilhas de imagens. Determine a localização das pilhas a serem analisadas. Selecione apenas uma série nesta etapa.

Esse é o primeiro arquivo, e o último arquivo deve ser o mesmo. Em seguida, selecione um local para a saída dos arquivos de dados e pilhas. Por exemplo, pasta de saída de dados.

Insira os valores de limite para subtrair o limite da razão e o limite da borda da célula. Mantenha as outras configurações em seus valores padrão. O algoritmo gerará uma janela com dois painéis, na qual a série processada é exibida à esquerda e a original à direita.

Abra este arquivo a partir da pasta de saída e examine-o cuidadosamente para avaliar o número de falsos positivos e as ocasiões em que eventos visíveis a olho nu não foram detectados. Para cada série, o algoritmo produz um arquivo Excel que detalha características dos eventos detectados, como amplitude, área e posição. Falsos positivos identificados ao revisar os arquivos de imagem gerados pelo algoritmo podem ser removidos manualmente deste arquivo Excel, embora você deva ter critérios rigorosos para fazê-lo.

Este é um vídeo da transitoriedade do cálcio no músculo liso. Neste exemplo, o vídeo é composto por 100 quadros individuais adquiridos a cinco hertz. Adquiriríamos muitos desses vídeos por experimento ao investigar, por exemplo, o efeito de uma droga específica na frequência do transiente de cálcio.

Aqui observamos inúmeros transientes espontâneos de cálcio nas células musculares lisas. O resultado do algoritmo de detecção de partículas é mostrado aqui. Para cada série, o algoritmo produz um arquivo Excel que detalha as características do evento detectado, como amplitude, área e posição.

Portanto, demonstramos um método para a aquisição de imagens de transientes de cálcio em órgãos musculares lisos, como a bexiga urinária, e mostramos uma maneira de analisar esses transientes de cálcio utilizando um algoritmo desenvolvido em nosso laboratório. Os pontos importantes a serem lembrados são preparar bem o tecido para a aquisição de imagens de cálcio. No caso do tecido que demonstramos hoje, isso significa remover o tecido conjuntivo e toda gordura que possa obstruir o campo.

Também é importante fixar o tecido em uma lâmina plana. Bom sucesso em seus experimentos e obrigado por assistir.