A imunocoloração lote de Grande Escala da detecção de proteínas no cérebro do macaco inteiro

Este procedimento inicia-se após o recebimento de um cérebro perfundido com PFA a 4%, externalizado e crioprotegido, que foi enviado aos colaboradores em neurociência para inclusão, utilizando marcos de alinhamento embutidos na matriz circundante. O cérebro pode ser seccionado no plano coronal para produzir cortes seriados com espessura desejada, os quais representarão toda a extensão ântero-posterior do cérebro, utilizando cestos e recipientes especializados. Pode-se realizar o processamento imunológico em lotes para determinar o padrão espacial de expressão de uma proteína em todo o cérebro.

Olá, sou o Dr. Shaheen Zur do Laboratório de Neurociências Visuais da Escola de Optometria da Universidade de Montreal. Olá, sou o Dr. Mark Burke, também do Laboratório de Neurociências Visuais da Escola de Optometria da Universidade de Montreal. Olá, sou o Dr. Mo Petto, diretor do Laboratório de Neurociência Visual da Escola de Optometria da Universidade de Montreal.

Hoje vamos mostrar um procedimento para imunomarcação em lote para detecção em larga escala de proteínas em um cérebro inteiro de macaco. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar os padrões de expressão de proteínas-alvo em todo o cérebro e para comparar e contrastar a expressão dessas proteínas dentro do mesmo cérebro. Então, vamos começar.

Antes do processamento histológico, obtenha um cérebro de primata que tenha sido preservado por meio de perfusão sistêmica e pós-fixação, e protegido com crioprotetor utilizando soluções de sacarose em gradiente. Nesta etapa, o cérebro é enviado à Neuroscience Associates para ser incluído e seccionado livremente usando sua tecnologia proprietária. Após o retorno, observa-se que sete marcos de alinhamento foram colocados na matriz de inclusão, de modo que as secções possam ser orientadas corretamente e realinhadas após a conclusão do processamento histológico.

Enquanto o corte é realizado, são obtidas imagens digitais que posteriormente podem ser usadas para a reconstrução tridimensional de mapas anatômicos. A Neuroscientist Associates processa nosso tecido para obter cortes coronais seriados, flutuantes livres, com espessura de 50 micrômetros ao longo de todo o cérebro. Uma vez concluído, podemos iniciar o processamento histológico dos cortes.

Quando iniciamos o processamento histológico, geralmente temos cerca de 140 cortes para manipular por anticorpo ou coloração. Aqui demonstraremos a técnica com uma amostra menor de cortes tratados com o anticorpo SMI 32, que é um anticorpo monoclonal contra proteínas de neurofilamentos não fosforiladas. Durante todo o procedimento, são utilizados recipientes e cestos especiais para coloração, permitindo que um grande número de cortes em flutuação livre seja processado simultânea e eficientemente.

Isso garante que a coloração resultante seja consistente em todas as seções. O primeiro passo é incubarem-se as seções em uma solução à base de PBS contendo TRITON X-100 e soro normal de cavalo por 60 minutos. Isso reduzirá a ligação inespecífica de moléculas de anticorpo, o que resulta em coloração de fundo.

Em seguida, os cortes são incubados durante a noite. Em uma solução de anticorpo SMI 32 baseada em PBS, suplementada com Triton X 100 e soro de cavalo normal, no dia seguinte, os cortes são lavados por três períodos de 10 minutos em solução de lavagem e, então, incubados por duas horas à temperatura ambiente em uma solução de anticorpo secundário biotinilado Muse baseada em PBS, contendo Triton X 100 e soro de cavalo normal.

Após uma série de três lavagens adicionais de 10 minutos, os cortes são colocados em uma solução do complexo de avidina-biotina conjugada com peroxidase de rábano-picante por uma hora à temperatura ambiente. Finalmente, após outra série de lavagens, os cortes são colocados em uma reação com diaminobenzidina por 10 minutos, que produz uma coloração marrom nas células neuronais imunorreativas. A reação é então interrompida removendo-se a bandeja de coloração e imergindo-se os cortes em PBS.

Após duas ou três lavagens de cinco minutos em PBS, as seções estão prontas para serem montadas individualmente em lâminas de vidro para iniciar o processo de montagem, utilizando uma placa de Petri grande e pincéis de pintura muito macios. As seções são retiradas do recipiente com tampão PBS e montadas individualmente em lâminas de vidro revestidas com gelatina. Em seguida, as amostras são deixadas secar ao ar durante a noite em uma cabine de segurança, no dia seguinte.

As seções são lavadas mergulhando-as em água desionizada para remover quaisquer cristais de sal que possam ter sobrado do processo de montagem. Em seguida, as lâminas são desidratadas em etapas com etanol em gradiente, limpas em xilol e montadas com lamínula utilizando meio de montagem per mount. Nesta etapa, as lâminas devem ser armazenadas por cerca de uma semana a dez dias em posição horizontal para permitir que o meio de montagem endureça.

Após isso, as lâminas podem ser armazenadas em uma caixa de lâminas ou submetidas à obtenção de imagens por microscopia. Este método produz um perfil completo de expressão de uma proteína alvo de interesse em todo o cérebro de macaco. Aqui mostramos seções coronais representativas que fornecem uma visão instantânea da expressão de FMRP, nova n e SMI 32.

No mesmo cérebro de macaco. Acabamos de mostrar como realizar a imunomarcação em lote para uma proteína-alvo de interesse em todo o cérebro. Ao realizar este procedimento, é importante garantir que todas as seções sofram agitação suave durante a incubação em várias soluções e que permaneçam completamente imersas em todo momento.

Além disso, tenha calma ao montar as dissecações em lâmina de vidro e remova o máximo possível das rugas e dobras sem danificar a integridade do tecido. Assim sendo, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.