Técnicas de microinjeção para estudar na Mitose Drosophila melanogaster Embrião Sincicial

Este procedimento inicia-se com a coleta de embriões em placas de suco de uva fresco durante 30 a 60 minutos. Após remover a placa da gaiola do lago, pegue os embriões com um pincel umedecido e coloque-os em fita adesiva dupla. Rode suavemente um embrião sobre a fita usando uma das extremidades de uma pinça até que o córion se rompa.

Pegue o embrião e coloque-o suavemente sobre a lamínula. Aplique uma camada de cola het. Repita isso até que você tenha embriões suficientes.

Após a desidratação, os embriões estão prontos para a injeção. Olá, sou Ingrid Bruce Musher do laboratório do Dr. Jonathan Sculley, do Departamento de Biologia Molecular e Celular da Universidade da Califórnia em Davis. Hoje vamos mostrar um procedimento para microinjeção de embriões sinciciais de drosófila.

Utilizamos este procedimento para estudar o papel dos microtúbulos e dos motores baseados na mitose na mitose. Por exemplo, injetamos microscópicamente anticorpos ou outros inibidores de proteínas mitóticas específicas. Ao analisar o efeito do inibidor sobre a mitose, somos capazes de determinar a função da proteína-alvo.

Então vamos começar. Para iniciar os preparativos dois ou três dias antes do experimento, monte a gaiola de postura cortando dois pequenos orifícios de aproximadamente um centímetro quadrado em lados opostos de uma garrafa plástica. Preencha os orifícios com um pedaço de algodão, permitindo a circulação de ar.

Bata levemente no frasco para fazer as moscas caírem dentro dele e, em seguida, cubra-o com uma placa de suco de uva. Com levedura, mantenha a gaiola com as moscas à temperatura ambiente; elas colocarão ovos por até 10 dias, pelo menos um dia antes do experimento. Prepare as agulhas para injeção e mantenha-as a quatro graus Celsius.

No dia do experimento, prepare e carregue as agulhas. Primeiro, retire a tubulina rotulada do congelador e coloque-a no gelo por cinco a 15 minutos. Em seguida, dilua-a com tampão GPEM e, depois, centrifugue-a por 10 a 15 minutos a 13.000 RPM a quatro graus Celsius.

Por fim, carregue um a dois microlitros na agulha e mantenha-a a quatro graus Celsius para evitar a polimerização induzida por temperatura na agulha. Antes de montar a lamínula, prepare cola de heptano enrolando fita adesiva dupla face e colocando-a em um frasco de 100 mililitros.

Adicione cerca de 50 mililitros de heptano, feche o frasco e agite-o por vários dias. Antes de preparar os embriões, monte uma câmara de desidratação na qual os embriões serão colocados previamente à injeção. Para isso, coloque uma parte de uma placa de 35 milímetros dentro de uma placa de Petri de 100 milímetros para formar uma plataforma, adicione um desidratante, como sulfato de cálcio anidro, ao redor dela, de modo que a altura do desidratante não ultrapasse a da plataforma, e cubra.

Para começar a preparar os embriões, colete-os primeiro da gaiola no lago trocando o prato de suco de uva com levedura a cada hora; os embriões devem ser observados cerca de duas horas após o início da coleta. Para preparar a lamínula, coloque-a em um dos lados de uma lâmina de microscópio e fixe as quatro pontas com fita adesiva para que não se mova. Usando um aplicador de algodão, coloque uma camada de cola de heptano em linha sobre a lamínula.

A cola não deve ser viscosa e deve secar em alguns segundos. Se estiver muito espessa, adicione mais heptano. Por fim, coloque um pedaço de fita adesiva dupla face no lâmina ao lado da lamínula.

Deslize com um pincel umedecido. Retire cuidadosamente os embriões da placa de suco de uva e coloque-os sobre a fita adesiva dupla face do lâmina. Em seguida, use uma das extremidades de uma pinça para rolar os embriões sobre a fita adesiva dupla face até que o córion se rompa.

Pegue o embrião rolando-o suavemente sobre o Corian para que adere à pinça e coloque-o sobre a cola de heptano na lamínula. Posicione-o com o lado longo do embrião paralelo ao lado longo da lamínula. Coloque 10 a 20 embriões em uma única fileira.

Remova a lamínula e coloque-a na câmara de desidratação por três a oito minutos. O tempo depende da umidade local e da quantidade a ser injetada. Em seguida, coloque a lamínula sobre uma câmara metálica com graxa de vácuo.

Por fim, cubra os embriões com óleo de halo carbono para evitar desidratação adicional. Os embriões estão agora prontos para a injeção. Primeiro, localize os embriões sob uma objetiva de 16 x.

Mova os embriões para longe e localize a agulha sem alterar o plano focal. Centralize a agulha e mova-a para cima sem deslocá-la nas direções X ou Y. Para abrir a agulha, coloque a borda da lamínula no campo de visão, mas não na posição onde a agulha estará.

E abaixe a agulha até o mesmo plano focal. Mova cuidadosamente a lamínula até que ela toque a agulha e a quebre suavemente. Levante a agulha.

Agora coloque os embriões em vista. Abaixe a agulha no óleo e certifique-se de obter gotas líquidas bem definidas a partir da agulha. Mova suavemente o embrião para dentro da agulha, injete uma gota no embrião e, em seguida, afaste o embrião.

Após todos os embriões terem sido injetados, eles estão prontos para serem observados em um microscópio confocal com uma objetiva de 60 ou 100 x. Um embrião controle deve apresentar-se como o do filme apresentado. Este é um embrião expressando tubulina GFP e histona RFP, imagens obtidas com uma objetiva de 100 x em um microscópio confocal de disco giratório.

O tempo total mostrado é de oito minutos. Os gráficos da distância de polo a polo são altamente reprodutíveis e constituem uma medida confiável de sucesso em embriões controle. Eles devem ser semelhantes aos mostrados aqui para os ciclos 11 a 13.

Mostrado neste vídeo está outro embrião controle. Este expressa KLP61F-GFP e foi injetado com tubulina marcada com Alexa Fluor 568. Ele também foi visualizado com uma objetiva de 100x em um microscópio confocal de disco giratório, e o tempo total é de sete minutos.

Este filme foi obtido imediatamente após a microinjeção, e o gradiente na concentração de tubulina r Domine é claramente visível no início do filme. Esses embriões podem ser utilizados para estudar a inibição da Klp 61 F após a microinjeção do anticorpo contra Klp 61 F. Podemos observar a perda da Klp 61 FGFP dos fusos.

Acabamos de mostrar como microinjetar embriões de Drosophila em estágio de blastodermo. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de realizar controles, primeiramente praticar a injeção de tampão ou rutina isoladamente, e certificar-se de que a mitose prossiga normalmente durante a fase celular. Uma vez que todas as suas injeções sejam confiáveis e não causem danos, você poderá injetar um inibidor e estudar o efeito dessa inibição específica.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.