A criação de embriões quiméricos Zebrafish por Transplante

Olá, sou Hillary Kemp do Laboratório de Cecilia Owens. E eu sou Cecilia Owens. Hillary e eu estamos na divisão de ciências básicas do Centro de Pesquisa sobre Câncer Fred Hutchinson, em Seattle.

Hoje vamos mostrar uma técnica para produzir embriões de peixe-zebra quiméricos, também conhecidos como mosaicos genéticos. Este procedimento permite avaliar a base celular da função gênica durante o desenvolvimento. Podemos investigar se um determinado gene exerce sua função dentro das células com fenótipo mutante, denominada função autônoma celular, ou no ambiente dessas células, denominada não autonomia celular.

Nós produzimos esses mosaicos transplantando células entre embriões selvagens ou mutantes em estágio de blástula ou início de gástrula. Posteriormente, avaliamos a função gênica observando o fenótipo e o genótipo de células derivadas do doador no ambiente do hospedeiro. Então, vamos começar.

Nesta parte do protocolo, um corante de linhagem é injetado no embrião doador para que os destinos das células derivadas do doador possam ser acompanhados após o transplante. Qualquer variedade de ácidos nucleicos também pode ser injetada usando esta técnica; no entanto, omita a etapa de decoração ao injetar DNA. Antes de trabalhar com os embriões, prepare um recipiente de injeção inserindo uma lâmina de vidro em um ângulo de 45 graus através da parte mais larga de uma placa de Petri. Três quartos cheio de 1,2% aros em meio embrionário com penicilina-estreptomicina.

Remova a lâmina após o agar endurecer para formar um sulco biselado. Encha o sulco com meio embrionário penicilina-estreptomicina. Agora prossiga com a desagregação enzimática de embriões em estágio de uma célula.

Incube os embriões na fase de uma célula por um a cinco minutos em uma solução de pronase a 0,5 miligrama por mililitro. Monitore atentamente a desocoração.

Assim que o córion começar a colapsar visivelmente, submerja os embriões em água do sistema e, então, despeje toda a córion, mantendo os embriões posicionados na parte inferior da curvatura do bico. É realmente importante que os embriões não toquem a superfície da água mais uma vez, e a maioria deles já terá perdido o córion. Há alguns poucos girando ao redor da parte externa que não perderam.

Se algo ainda estiver em seu córion, então o ato de pipetar dessa forma fará com que saiam e liberará os embriões, de modo que nunca toquem a superfície da água. É importante manipular embriões revestidos com uma pipeta que tenha sido polida ao fogo para suavizar suas bordas. Transfira suavemente os embriões decapados frágeis para a calha do recipiente de injeção usando uma pipeta de vidro de grande orifício e polida ao fogo.

Em seguida, estamos carregando um único arquivo neste canal. Agora, os embriões estão prontos para serem injetados com um marcador de linhagem utilizando uma micropipeta de vidro puxada a fogo, precisamente calibrada, e um equipamento de injeção por pressão. Vamos usar um recipiente cheio de meio para embriões para quebrar a ponta da agulha e um recipiente cheio de óleo para calibrar a agulha.

Esta é apenas uma amostra comum de óleo mineral de grau laboratorial. Pegamos um par de pinças de relojoeiro afiadas e, enquanto observamos através das lentes oculares para determinar qual seria o tamanho adequado, posicionamos as pinças em ambos os lados da agulha e, então, quebramos suavemente a ponta, o que não consigo fazer sem olhar. Para determinar o volume de corante ou ribonucleotídeo que está sendo administrado. Antes de iniciar.

Meça o tamanho do bolo em uma placa com óleo mineral. A ponta da agulha deve ser quebrada de forma que um bolo de um nanolitro seja liberado com um ou dois pulsos do microinjetor. O volume do bolo pode ser calculado a partir de seu diâmetro, medido com um micrômetro de ocular.

Injete um nanolitro de uma solução de 1 a 3% de dextrana fluorescente diretamente no vitelo de embriões revestidos entre as fases de uma a quatro células. O que vou fazer é posicionar o embrião exatamente sob a agulha. Vou inserir suavemente a agulha no centro do vitelo e pressionar o pedal com o pé.

Uma vez iniciada a injeção, é importante injetar nos fluxos do vitelo para que o corante seja transportado para dentro das células. Essa injeção será suficiente para rastrear células em embriões quiméricos durante vários dias de desenvolvimento. Idealmente, realizamos isso antes que as células atinjam o estágio de quatro células. Incube os embriões injetados em baixa densidade em uma placa de Petri revestida, preenchida com meio de embrião fresco contendo penicilina e estreptomicina.

Observe que os embriões injetados tendem a ter uma taxa de desenvolvimento ligeiramente reduzida; incube os embriões em diferentes temperaturas, 25, 28 e 31 graus Celsius, para escalonar seu desenvolvimento e maximizar a janela de tempo na qual os transplantes podem ser realizados. O aparelho utilizado para o transplante celular na blástula de peixe-zebra consiste em uma seringa Hamilton com controle de avanço acoplada, por uma torneira de três vias, a um reservatório de óleo mineral e a um suporte de micropipeta por meio de um trecho de tubo flexível. Elimine todas as bolhas de ar do sistema, pois elas comprometerão sua capacidade de controlar a sucção e a pressão.

Utilize um microscópio estereoscópico com óptica de alta qualidade com, no mínimo, uma magnificação DX. Para controlar o posicionamento do suporte da micropipeta e da agulha, sugerimos um micromanipulador manual NARA shige. Certifique-se de que ele esteja fixado à bancada utilizando uma base magnética para evitar a transferência de vibrações para o transplante.

As agulhas para transplante são feitas a partir de pipetas capilares de vidro que são puxadas com uma leve afunilação em um puxador de eletrodos. Consulte o protocolo do JoVE do laboratório de Miriam Goodman para obter detalhes sobre como puxar pipetas sob um microscópio estereoscópico e quebrar a ponta da agulha puxada. Para transplantes no estágio de blástula, o diâmetro externo da agulha deve medir aproximadamente 50 a 60 micrômetros ou 30 a 40 micrômetros para uma transferência no estágio de gástrula.

Para uma transferência ao estágio gastro melhorar a penetração, uma ponta afiada precisa ser criada na extremidade da agulha utilizando primeiro uma micro-falha, alisando a ponta da agulha ao aproximá-la do filamento da micro-falha. Em seguida, gire a agulha para que a borda dianteira do bisel entre em contato com o filamento. Assim que a borda dianteira da agulha tocar o filamento, puxe-a rapidamente para longe, criando assim uma ponta em forma de barbante.

Para evitar danificar as células, a ponta biselada deve ser reta e a extremidade da agulha não deve apresentar curvatura. Com o equipamento e as agulhas de transplante preparados, você está pronto para produzir embriões quiméricos. Transplantes de blástula são utilizados para transferir células entre embriões quando não é necessário obter informações detalhadas do mapa de destino celular. Com exceção das células germinativas primordiais, a maioria das células geralmente ainda não está comprometida com um destino específico nesta fase.

O mapa de destino da blástula é tal que podemos distinguir entre células que darão origem ao ectoderma e células que darão origem ao mesoderma. O mesoderma e o endoderma localizam-se próximo à margem do embrião em estágio de blástula, enquanto os progenitores dérmicos, que darão origem ao sistema nervoso e à derme superficial, encontram-se mais afastados da margem do embrião. Assim, quando transplantamos células em embriões em estágio de blástula, podemos direcionar essas células para o mesoderma presumido ou para o ectoderma presumido.

Mas não podemos direcionar células a nenhuma região específica do ectoderma ou do mesoderma porque não sabemos. No estágio de blástula, onde está o lado dorsal do embrião, prepare previamente as placas de injeção colocando uma molde de plástico com fileiras duplas de saliências em forma de cunha numa placa de Petri, preenchida pela metade com 1,2%aros fundido em meio embrionário. Uma vez que o aros tenha solidificado, remova o molde, deixando fileiras de cavidades em formato triangular, cada uma com tamanho suficiente para acomodar um embrião.

Preencha o molde de transplante com meio embrionário contendo penicilina e estreptomicina, e carregue os embriões na fase de blástula individualmente em cada poço usando uma pipeta de vidro polida ao fogo. Em seguida, transfira os embriões para os poços de transplante, deixando-os inicialmente de lado. Organize os embriões de modo que os embriões doadores sejam colocados em uma coluna e os embriões receptores na coluna adjacente.

Posicione a placa sobre o estágio de forma que, quando a agulha de transplante penetrar no embrião, a agulha empurre o embrião contra a parede traseira de seu poço. Usando o micromanipulador, abaixe a agulha de transplante na placa em um ângulo bastante acentuado. Idealmente, a agulha de transplante deve penetrar no embrião em um ângulo aproximado de 45 graus.

Uma vez que a ponta da agulha esteja abaixo da superfície do meio embrionário, aspire uma pequena quantidade de meio embrionário para dentro da agulha girando o micrômetro que controla a seringa Hamilton. Para o controle mais preciso, a interface entre o óleo mineral e o meio embrionário deve permanecer na parte fina e cônica da agulha, não muito próxima à extremidade. Posicione suavemente o embrião doador com a agulha e, em seguida, recue a agulha e introduza-a no capuz da blástula do embrião na posição desejada.

Um golpe rápido e firme penetrará o embrião sem fazê-lo rolar. Aspire lentamente e com cuidado as células doadoras para dentro da agulha para evitar danificar as células. Evite aspirar gema para dentro da agulha após o número desejado de células ter sido coletado.

Inverta levemente a pressão para interromper a sucção e remova a agulha para posicionar o embrião hospedeiro. Ao mover o recipiente de transplante, pequenos ajustes na posição do embrião hospedeiro podem ser feitos girando-o suavemente com a agulha de transplante, desde que se tenha cuidado para não tocar na gema. Ao expelir as células doadoras no embrião hospedeiro, evite aspirar a gema para dentro do embrião, pois isso danificará e matará as células doadoras. Células de um único embrião doador podem ser transplantadas para múltiplos hospedeiros após a conclusão das transferências celulares.

Transfira os pares de hospedeiros doadores para os poços revestidos de uma placa de 24 poços para continuar o desenvolvimento. A única exceção à regra de as células não estarem comprometidas com destinos específicos no estágio de blástula são as células germinativas primordiais. As células germinativas primordiais são especificadas muito cedo no desenvolvimento e estão comprometidas com seu destino de célula germinativa primordial.

Desde um estágio muito inicial, as células germinativas primordiais localizam-se próximas à margem de um embrião em estágio de blástula e gástrula. Portanto, se o objetivo do experimento de transplante for transplantar células germinativas primordiais, então é muito importante de onde as células provêm no embrião doador e não é importante para onde elas vão no embrião hospedeiro. Assim, a regra é que, para células somáticas, é importante para onde elas vão no embrião hospedeiro, pois isso determinará seu destino.

No caso das células germinativas primordiais, é importante de onde elas vêm no embrião doador, porque seu destino já está determinado. Se o objetivo for transplantar células germinativas primordiais, então essas células precisam ser coletadas na margem da região posterior do embrião doador, onde estão localizadas bem próximas à margem do embrião, em quatro pequenos aglomerados de três ou quatro células cada, neste estágio de lâmina ou estágio avançado de desenvolvimento. E você precisa coletá-las com muito cuidado para não começar acidentalmente a aspirar a gema.

Ok, e foi isso que fiz ali, e agora estou passando para um embrião hospedeiro. As células germinativas primordiais migrarão espontaneamente para a região da crista genital do embrião em que estiverem. Portanto, não é necessário transplantar essas células germinativas primordiais para a margem, pois elas próprias chegarão até lá.

Então, estou apenas transplantando e colocando as células de volta em qualquer local no embrião pós-embrião. O ponto crucial para os transplantes de células germinativas, que é exatamente o oposto de qualquer outro tipo de transplante, é a origem das células doadoras. Transplantar células em um hospedeiro em estágio gastrular permite ao pesquisador aproveitar o mapa de destino do peixe-zebra que surge quando o escudo embrionário se torna visível.

Torna-se possível distinguir diferentes tipos de tecidos, bem como os domínios dentro do sistema nervoso central presumido. Ao transferir células entre embriões no estágio de gástrula, existem algumas variações no protocolo, mas o procedimento geral é semelhante ao trabalho com blastóporos para montar gástrulas. Primeiro, espalhe uma faixa vertical de metilcelulose na depressão de uma lâmina de vidro com depressão, depois encha com uma quantidade generosa de meio embrionário pen strep usando uma pipeta com ponta polida a fogo para transferência.

Um doador e três hospedeiros em estágio escudo para o deslizamento de depressão. Selecione embriões doadores ligeiramente mais jovens que os hospedeiros. Uma nova ferramenta é necessária para manipular a cola gastrossômica: insira as pontas de um pequeno trecho de linha de pesca de dois libras na extremidade de um tubo capilar.

Assim, forme um pequeno laço. Use o laço para rolar suavemente os embriões doadores e receptores até o topo da tira de Metilcelulose e empurre-os para dentro da Metilcelulose até que estejam firmes. Rode-os até a posição desejada, de modo que a região-alvo fique voltada para cima.

Como durante o transplante a agulha entrará tangencialmente no embrião para entregar as células doadoras sem danificar o vitelo, os transplantes na fase de gastrulação são melhor realizados em um microscópio composto de estágio fixo. Use os controles do micromanipulador para trazer a ponta da agulha de transplante ao foco.

Posicione o suporte da micropipeta e a agulha em um ângulo relativamente raso, de modo que a agulha fique o mais próximo possível da posição horizontal, permitido pela borda da depressão na lâmina. Em seguida, perfure o embrião doador. Se estiver montado corretamente, ele não girará quando a agulha de transplante penetrar, a menos que o embrião esteja muito velho, impedindo que a agulha penetre facilmente.

Para evitar perfurar o vitelo, a agulha deve penetrar o embrião em um plano focal ligeiramente mais profundo do que o do EDL. Após a perfuração, um grande número de células pode ser removido do doador para até três injeções em células hospedeiras. Ao aspirar as células, evite sugar o vitelo movendo a agulha conforme as células são coletadas, se desejado.

Embriões adicionais podem ser coletados para obter mais células utilizando a mesma agulha antes de ejetar as células no hospedeiro; durante a ejeção das células no embrião hospedeiro, expulse as células enquanto a agulha é retirada da área-alvo, ao invés de depositar as células em um único aglomerado. Isso aumentará a probabilidade de que as células doadoras contribuam para o tecido desejado. Após a conclusão das transferências celulares, coloque toda a lâmina em uma placa de Petri e cubra cuidadosamente com meio para embrião contendo penicilina-estreptomicina.

Nas próximas horas, a metilcelulose se dissolverá, liberando os embriões. O número de células transferidas depende do objetivo específico do experimento. Células de um único doador podem ser transplantadas para três ou quatro hospedeiros na manhã seguinte ao transplante.

Os hospedeiros podem ser examinados para determinar se o direcionamento das células doadoras foi bem-sucedido. O transplante bem-sucedido de células germinativas primordiais da fase de blástula resulta em células marcadas com fluorescência, posicionadas ventralmente próximo à junção entre o ylk e a extensão do ylk. Assim, acabamos de mostrar como realizar transplantes nas fases de gástrula e blástula.

Ao realizar esta técnica, é importante escolher o tipo adequado de método de transplante para o tecido-alvo que se deseja atingir com suas células. Assim, o transplante em estágio de blástula é suficiente para determinar se as células vão para a derme ou para o ectoderma. Além disso, é possível utilizar esta técnica para direcionar células germinativas primordiais.

Se você deseja realizar um mapeamento mais preciso, é melhor usar um transplante de estágio gástrula em que o lado dorsal já tenha sido determinado. Com essa técnica, é possível direcionar células para várias partes do sistema nervoso, em particular, o prosencéfalo, mesencéfalo, rombencéfalo e medula espinhal. É isso aí.

Muito obrigado por assistir e boa sorte em todos os seus experimentos.