Um método de alta taxa de transferência para Zebrafish criopreservação de espermatozóides e In Vitro Fertilização
6 de julho de 2009
Este é um high-throughput protocolo de criopreservação de esperma para zebrafish. Espermatozóides criopreservados utilizando este protocolo tem uma média de fertilidade de 25% na fertilização in vitro subseqüentes e é estável durante muitos anos.
Olá, sou Bruce Draper da Universidade da Califórnia, Davis, Departamento de Biologia Molecular e Celular, e sou Cecilia Moans da Divisão de Ciências Básicas do Centro de Pesquisa sobre Câncer Fred Hutchinson, em Seattle. Hoje, Cecilia e eu vamos demonstrar o protocolo de criopreservação de esperma de peixe-zebra, que é uma modificação do protocolo original de Brian Harvey. Vamos mostrar a vocês que, trabalhando em equipes de duas pessoas, é possível criopreservar esperma de 100 machos individuais em menos de duas horas.
Embora haja uma ampla variação na fertilidade após o descongelamento, em média, obtemos 25% de fertilidade, e isso provém de uma biblioteca que foi criopreservada por mais de sete anos. Então, vamos começar. Antes de realizar este procedimento, primeiramente, prepare as soluções de congelamento de espermatozoides.
A solução de Ringer para peixes Ginsburg é preparada fresca a cada três dias, e o meio de congelamento é preparado fresco diariamente, com e sem metanol. A composição dessas soluções pode ser encontrada nas informações suplementares online que acompanham este protocolo. Os materiais utilizados neste procedimento podem afetar a taxa de congelamento e descongelamento, o que por sua vez pode afetar a fertilidade do esperma congelado.
Por esse motivo, uma lista de materiais recomendados também é fornecida como informação suplementar on-line. É preferível congelar o esperma em gelo seco finamente triturado, em vez de pelotas de gelo seco. Uma maneira simples de triturar o gelo seco é envolvê-lo em uma toalha e pulverizá-lo com um martelo.
Um método mais eficiente é usar um moedor de gelo seco, como o modelo RE com garras, para congelar o esperma de peixe-zebra. Primeiro, marque tubos capilares de 10 microlitros com uma caneta de laboratório no nível de 3,33 microlitros ou cerca de 16,7 milímetros a partir da base. Para anestesiar os machos, coloque dois a quatro machos em um béquer contendo água para peixes com trica diluída. A receita pode ser encontrada no livro do peixe-zebra.
Uma vez anestesiado, levante o peixe do anestésico usando uma colher de plástico e seque-o suavemente em uma toalha de papel. Preste especial atenção em secar o lado ventral. A água ativa os espermatozoides, portanto é fundamental secar completamente ao redor do ika.
Posicione o peixe no suporte de esponja com o lado ventral voltado para cima. Se a região ao redor das nadadeiras pélvicas ainda estiver úmida, seque-a suavemente com um lenço de papel Kim. Coloque o tubo capilar marcado em um adaptador de pipeta de borracha que acompanha os tubos capilares.
O adaptador é uma mangueira de borracha que possui um bocal em uma extremidade e um suporte para capilar na outra. Alternativamente, o tubo capilar pode ser conectado a uma seringa Hamilton de 50 microlitros. Usando um pequeno pedaço de tubo de tigon com o diâmetro apropriado, coloque o macho sob o microscópio e exponha a abertura urogenital separando cuidadosamente as nadadeiras pélvicas.
Usando a extremidade do tubo capilar, expulse o esperma massageando suavemente os lados do peixe com pinças lisas ou apertando levemente os lados do peixe com o indicador e o polegar; colete o esperma em um tubo capilar à medida que for expelido, utilizando sucção suave. Evite fezes que possam ser expelidas junto com o esperma. O volume alvo de esperma é de 3,3 microlitros.
A quantidade mínima de esperma aceitável varia conforme a qualidade do esperma. O esperma bom é branco e opaco, enquanto o esperma ruim tem aparência aquosa. De modo geral, a quantidade mínima aceitável de esperma é um microlitro de esperma bom ou um terço do alvo, e dois microlitros de esperma ruim ou dois terços do alvo.
Se o volume de esperma não atingir o volume-alvo de 3,3 microlitros, é necessário normalizar o volume até a marca da caneta usando meio de congelação sem metanol. Se o volume de esperma já atingir ou ultrapassar a marca da caneta no tubo capilar, prossiga para a próxima etapa. Agora, adicione o crioprotetor ao esperma.
Aspire o meio congelante com metanol até a marca laranja. O volume total aproximado agora é de 20 microlitros. Expulse suavemente a mistura de espermatozoides e crioprotetor em uma área limpa de uma lâmina de relógio, misturando delicadamente por pipetagem para cima e para baixo cerca de quatro vezes, evitando introduzir bolhas.
Aliquotar o esperma em dois tubos criogênicos pipetando 10 microlitros da solução crioprotetora de esperma no fundo de cada tubo identificado. Tampe rapidamente os tubos e coloque cada tubo criogênico em um tubo Falcon separado de 15 mililitros. À temperatura ambiente, tampe os tubos Falcon e insira-os em gelo seco finamente pulverizado.
Os tubos devem ser inseridos profundamente o suficiente para que apenas as tampas fiquem visíveis, a fim de facilitar o acompanhamento dos tubos de falcão. Numere-os e registre o horário em que cada tubo é colocado no gelo seco. Deixe o esperma congelar no gelo seco por 20 minutos.
Após o congelamento do esperma, transfira os dois frascos de criopreservação para um frasco dewar contendo nitrogênio líquido, para armazenamento temporário. Coloque a caixa de congelamento em um banho de nitrogênio líquido para que as amostras não aqueçam.
Use pinças metálicas longas para recuperar os frascos do frasco doer e manuseie-os com luvas criogênicas. Alternativamente, os frascos criogênicos podem ser transferidos diretamente do gelo seco para o congelador. Se a caixa do congelador for mantida imersa em nitrogênio líquido em um recipiente de isopor para armazenamento de longo prazo, coloque os frascos criogênicos em um congelador criogênico de nitrogênio líquido.
Para manter a viabilidade dos espermatozoides, é fundamental que os frascos sejam armazenados imersos em nitrogênio líquido; frascos armazenados na fase de vapor podem perder viabilidade ao longo do tempo. A velocidade também é essencial para manter a viabilidade espermática. O tempo entre a adição do crioprotetor e a colocação dos frascos de espermatozoides no gelo seco não deve ultrapassar 30 segundos fertilização in vitro.
O uso de espermatozoides criopreservados funciona melhor com duas pessoas. Uma pessoa extrai os óvulos das fêmeas enquanto a outra descongela o esperma. Aqueça um banho-maria a 33 graus Celsius.
Retire um tubo criogênico do freezer de nitrogênio líquido e transfira-o para um frasco D ou recipiente contendo nitrogênio líquido até o momento do descongelamento. Esprema os ovos de fêmeas anestesiadas em uma placa de Petri plástica de 35 milímetros. Isso é descrito em detalhes no protocolo JoVE intitulado Produção de peixes-zebra gino-genéticos por pressão precoce, que fornece uma descrição detalhada do peixe-zebra.
A fecundação in vitro, um bom conjunto contém mais de 150 ovos que são uniformes e amarelados. Qualquer resíduo branco indica degradação. Se possível, tente obter três conjuntos de ovos e combine-os em um único recipiente.
Se três boas posturas não forem obtidas dentro de um minuto após a primeira postura, prossiga para o próximo passo. Mantenha a placa coberta enquanto o esperma é descongelado. Enquanto isso, retire o frasco do nitrogênio líquido e remova a tampa.
Mergulhe rapidamente o tubo até a metade em um banho-maria de 33 graus por oito a 10 segundos. Adicione rapidamente 70 microlitros de solução salina tamponada de Hank à temperatura ambiente ao tubo e misture pipetando para cima e para baixo; imediatamente, adicione aos ovos na placa de Petri e misture suavemente com a ponta da pipeta. Em seguida, ative imediatamente os espermatozoides e ovos adicionando 750 microlitros de água para peixes, gire para misturar e incube por cinco minutos à temperatura ambiente.
Após cinco minutos, encha o recipiente com peixes, água e incube a 28 graus Celsius. Após duas a três horas, conte e transfira os embriões viáveis para placas de 100 milímetros, com 50 embriões por placa. Conte também os ovos fertilizados para que a fertilidade da amostra de esperma possa ser determinada.
A fertilidade dos espermatozoides é a razão entre embriões viáveis e o número total de ovos utilizados para a fertilização in vitro. Os ovos podem ser classificados a qualquer momento entre duas e seis horas após a fertilização in vitro. Quando os ovos inférteis são facilmente diferenciados dos embriões viáveis, os ovos inférteis são claros e não divididos.
Quando observado com iluminação transmitida em um microscópio estereoscópico, a fertilidade média do esperma criopreservado varia amplamente. No entanto, deve ser possível obter uma fertilidade média de 25%, estável por vários anos. Este gráfico mostra a porcentagem média de fertilidade do esperma congelado entre 2001 e 2003 e analisado tão recentemente quanto em 2008.
Acabamos de demonstrar um método de alto rendimento para criopreservação de espermatozoides de peixe. Ao realizar este protocolo, é importante utilizar todos os equipamentos e utensílios plásticos recomendados, bem como gelo seco moído pulverizado em vez de pelotas de gelo seco. É fundamental utilizar espermatozoides e óvulos de qualidade muito alta, e no caso dos óvulos, ao realizar a fertilização in vitro, logo após a ativação do espermatozoide, é importante utilizar o maior número possível de óvulos para aumentar o número de embriões férteis obtidos ao final, o que pode exigir três a quatro fêmeas, correto?
Outro componente fundamental do protocolo é a velocidade. Nunca deve levar mais do que cerca de um minuto desde a expressão do esperma do macho até colocá-lo no gelo seco. Bem, acho que é isso.
Boa sorte com seus experimentos.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo de criopreservação de esperma de peixe-zebra em alto rendimento, alcançando uma taxa média de fertilidade de 25% em fertilizações in vitro subsequentes. O protocolo é estável ao longo de muitos anos, permitindo o armazenamento eficaz de esperma de peixe-zebra a longo prazo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Reprodutiva
- Técnicas de Criopreservação
Contexto
- O peixe-zebra é um organismo modelo na pesquisa biológica.
- A criopreservação é essencial para o armazenamento de longo prazo de material genético.
- A manutenção da viabilidade dos espermatozoides é fundamental para a fertilização bem-sucedida.
- Os protocolos para criopreservação de espermatozoides podem variar em eficácia.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método de alto rendimento para criopreservação de esperma de peixe-zebra.
- Avaliar a fertilidade do esperma criopreservado ao longo do tempo.
- Fornecer um protocolo confiável para pesquisadores da área.
Métodos Utilizados
- Preparação de soluções de congelamento de espermatozoides e crioprotetores.
- Coleta de espermatozoides de peixes-zebra machos anestesiados.
- Congelamento de espermatozoides utilizando gelo seco e nitrogênio líquido.
- Descongelamento de espermatozoides para fertilização in vitro.
Resultados Principais
- Taxa média de fertilidade de 25% a partir de espermatozoides criopreservados.
- O protocolo permite a criopreservação de espermatozoides de 100 machos em menos de duas horas.
- A viabilidade dos espermatozoides é mantida por um período superior a sete anos.
- Técnicas específicas aumentam a taxa de sucesso da criopreservação.
Conclusões
- O protocolo desenvolvido é eficiente e eficaz para a criopreservação de esperma de peixe-zebra.
- Altas taxas de fertilidade podem ser alcançadas com técnicas adequadas.
- Este método pode apoiar estudos genéticos de longo prazo em peixe-zebra.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A criopreservação de esperma de peixe-zebra permite o gerenciamento de recursos genéticos de longo prazo na descoberta pré-clínica, apoiando a disponibilidade consistente de modelos para validação de alvos e triagem fenotípica. O protocolo de alto rendimento permite a criopreservação de 100 amostras de machos em menos de duas horas, melhorando a eficiência operacional em repositórios genéticos em larga escala. Taxas estáveis de fertilidade de 25% ao longo de vários anos fornecem resultados previsíveis para ensaios de fertilização in vitro posteriores, reduzindo a variabilidade em experimentos genéticos de cruzamento.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses genéticas ao preservar linhagens de espermatozoides para cruzamentos futuros que validem a função gênica em sistemas relevantes para doenças.
- Valor Operacional: Procedimentos padronizados de coleta e congelamento de espermatozoides reduzem a variabilidade técnica, favorecendo a desvinculação reprodutível de alvos entre laboratórios.
- Valor Preditivo: A capacidade de armazenamento de longo prazo permite testar retrospectivamente modelos genéticos à medida que surgem novos alvos, aumentando a confiança na continuidade translacional.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: O esperma criopreservado fornece uma entrada biológica uniforme para ensaios de fertilização in vitro, permitindo métricas consistentes de conversão de óvulo em embrião para triagem de compostos.
- Valor Operacional: O uso de criotubos em vez de tubos capilares melhora o manuseio de amostras e a escalabilidade do armazenamento em fluxos de trabalho de alto rendimento.
- Prontidão do Ensaio: Volumes normalizados de esperma utilizando meio de congelamento livre de metanol aumentam a uniformidade do procedimento, favorecendo resultados quantitativos confiáveis em ensaios de fertilização.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Taxas de fertilidade estáveis ao longo de sete anos apoiam estudos pré-clínicos de longa duração que exigem fundos genéticos consistentes para a caracterização do mecanismo de ação e perfis de segurança.
- Redução de Riscos Preditiva: A viabilidade confiável do esperma reduz a perda durante a geração de modelos genéticos, melhorando as taxas de sucesso em pipelines de validação de alvos guiadas por fenótipos.
- Sistema Relevante para Doenças: Embriões de peixe-zebra derivados de esperma criopreservado permitem avaliação fenotípica rápida em modelos vertebrados alinhados a vias de doenças humanas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao fornecer um processo upstream escalonável para a geração de embriões de peixe-zebra utilizados na validação de alvos, desenvolvimento de ensaios e triagem fenotípica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir a geração sob demanda de embriões geneticamente definidos a partir de linhagens de espermatozoides arquivadas.
- Triagem: O espermatozoide criopreservado melhora a reprodutibilidade e a produtividade de ensaios baseados em fertilização in vitro para triagem de compostos ou supressores genéticos.
- Análises: As medidas de taxa de fertilidade (embriões viáveis por número total de ovos) fornecem um ponto final quantitativo para avaliação da qualidade do esperma e da eficiência do cruzamento genético.
- Pesquisa Translacional: O armazenamento prolongado de espermatozoides garante a continuidade desde a descoberta de genes até a validação pré-clínica, utilizando fundos genéticos consistentes.
- Reutilização Institucional: O protocolo estabelece uma capacidade de gerenciamento de recursos genéticos reutilizáveis para instalações de grande escala de peixe-zebra que apoiam múltiplos projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na disponibilidade de modelos genéticos, redução da ambiguidade mecanicista em estudos transgeracionais.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade do processamento de esperma permitem o biobancamento em alto rendimento.
- Valor Estratégico: Tomada de decisão mais eficaz sobre investimentos em modelos genéticos, eficiência do capital na manutenção de colônias vivas, redução do risco biológico em estudos longitudinais.
- Impacto sobre o Portfólio: Priorização ajustada ao risco de linhagens genéticas com base nas taxas de sucesso da criopreservação e na estabilidade da fertilidade a longo prazo.
Considerações sobre a Implementação
- Expertise necessária no manejo de peixes-zebra, extração de esperma e técnicas de criopreservação.
- Os equipamentos necessários incluem moinho de gelo seco, armazenamento de nitrogênio líquido, tubos capilares, crioviales e banhos-maria com temperatura controlada para descongelação.
- A padronização entre equipes exige adesão aos materiais especificados (por exemplo, gelo seco finamente triturado, tubos recomendados) para controlar as taxas de congelamento e descongelamento que afetam a fertilidade.
- As considerações de adaptação incluem a normalização do volume de esperma utilizando meio de congelamento livre de metanol, para garantir preparação uniforme das amostras frente a variações na produção dos machos.
- Limitações práticas: a fertilidade varia conforme a amostra; o sucesso do protocolo depende da qualidade do esperma e dos óvulos, com limiares mínimos aceitáveis de volume de esperma definidos.
