Visualizar o coração batendo no Drosophila

Duas técnicas serão apresentadas aqui para a visualização de um coração pulsante em Drosophila para a dissecação do coração adulto. Primeiro, a cabeça e o tórax são removidos por um único corte ao longo da linha indicada. Em seguida, as genitálias são removidas e a cavidade corporal abdominal é aberta usando pinças; o intestino, e no caso de uma mosca fêmea, os ovários, são removidos.

O corpo adiposo abdominal nos segmentos abdominais três e quatro é cuidadosamente aspirado para expor o coração adulto e permitir a imobilização do coração larval. Uma única larva colocada em solução tampão é fixada aplicando-se primeiro cola histo acral ao redor da região da cabeça da larva. A larva é levemente esticada e mais cola é aplicada na extremidade posterior e depois nas laterais da parede corporal da larva.

Olá, sou GI Fler. Olá, sou Karen er. Ambos somos membros do programa de Desenvolvimento e Envelhecimento do Instituto Burnham de Pesquisa Médica.

Hoje vamos mostrar os procedimentos que desenvolvemos para visualizar o coração pulsante de drosófilas larvais e adultas. Utilizamos ambos esses preparos como forma de visualizar, examinar e quantificar parâmetros cardíacos na mosca-das-frutas, Drosophila. Antes de começar, preparamos inicialmente uma solução artificial de hemolinfa.

Esta solução contém a entrada de sacarose, helo, que deve ser adicionada ao hemolinfa artificial a partir de soluções estoque refrigeradas imediatamente antes do uso. Para prevenir contaminação bacteriana, aqueça o hemolinfa artificial até a temperatura ambiente e oxigene a solução por borbulhamento de ar por pelo menos 15 minutos. Em seguida, puxe vários capilares finos utilizando um puxador de pipetas padrão, que serão necessários para a remoção dos corpos gordurosos na mosca.

Uma vez que tudo tenha sido preparado, as moscas adultas devem ser anestesiadas. Isso pode ser feito mediante exposição breve ao fly nap por dois a cinco minutos, mas tome cuidado para não deixar as moscas no fly nap por mais de cinco minutos. A exposição de curta duração ao frio também pode ser utilizada para anestesiar as moscas, mas o dióxido de carbono não é recomendado, pois possui efeitos prolongados na frequência cardíaca e na ity.

Em seguida, as moscas anestesiadas são colocadas com a face dorsal voltada para baixo em uma placa de Petri revestida com uma fina camada de vaselina. A cutícula hidrofóbica das asas e do corpo deve aderir reversivelmente à vaselina, mas a mosca pode ser reposicionada, se necessário. Um corte inicial é feito usando uma tesoura curva de mola.

Isso é feito colocando as lâminas da tesoura sob as pernas da mosca e inclinadas para baixo, em direção à superfície dorsal, próximo ao pescoço. O cordão nervoso ventral da cabeça e as pernas são removidos com um único corte. Em seguida, o preparo é submerso na solução artificial de hemolinfa oxigenada usando tesouras de aço flexível.

A ponta posterior do abdômen, composta pelos segmentos abdominais sete e oito, é removida com um único corte. Isso permite o acesso para realizar cortes laterais ao longo das duas bordas do abdômen e serve para seccionar a conexão entre o intestino posterior e o cutículo abdominal. Insira as lâminas da tesoura na pequena abertura na ponta do abdômen e corte o cutículo lateralmente.

Isso libera uma borda da cutícula ventral. Segure a aba com pinça e faça um corte semelhante ao longo da borda lateral oposta do abdome. A aba solta da cutícula abdominal ventral pode agora ser removida.

Os intestinos e outros órgãos abdominais geralmente podem ser removidos como um único conjunto usando pinças de ourives e puxando suavemente. A remoção dos órgãos internos revela o tubo cardíaco pulsante, que ainda está preso à cutícula dorsal por pequenos músculos arteriais e é rodeado por corpos adiposos. Os capilares puxados são inseridos em tubos plásticos de um dezesseis avos de polegada, conectados a uma fonte de vácuo.

A força de sucção é proporcional ao diâmetro da ponteira; portanto, pipetas com ponteiras maiores que 40 microns de diâmetro não devem ser utilizadas após o preparo. Este sistema de sucção é usado para remover o excesso de gordura ao redor do tubo cardíaco. Também pode ser empregado para eliminar bolhas de ar que se acumulam ao redor da cutícula e quaisquer detritos.

Deve-se ter extrema cautela para evitar tocar o próprio coração, e como a porção posterior do coração é muito frágil, essa região também deve ser evitada. O tubo cardíaco de drosófila adulta agora está exposto e deve estar batendo, se necessário. A cutícula e o coração nela aderido podem ser reposicionados levantando suavemente a cutícula do gel de petróleo e acomodando-a cuidadosamente novamente.

Evitando qualquer contato com o tecido cardíaco. Neste momento, a solução que banha o preparo deve ser substituída por hemolinfa artificial fresca. Esse preparo deve ser deixado equilibrar por 20 a 30 minutos com oxigenação antes de quaisquer manipulações.

Se o preparo precisar ser mantido por mais de 60 minutos, deve ser reperfundido com hemolinfa artificial fresca. Este preparo está agora pronto para ser usado em gravações ópticas e também pode ser utilizado em gravações eletrofisiológ游戏副本s ou em manipulações histológicas. Uma técnica diferente é necessária para visualizar o coração pulsante intra-larval.

Primeiro, prepare as lamínulas no dia anterior ao procedimento. Isso é feito usando um palito para transferir cerca de 50 a 70 microlitros da solução Sard para uma lamínula de 22 por 22 milímetros. Deixe o selante syl curar a 65 graus celsius durante a noite.

Em seguida, prepare o tampão de Brody e Bates; uma vez preparado, alíquotas podem ser armazenadas a menos 20 graus Celsius e descongeladas conforme necessário. Por fim, prepare as ferramentas necessárias para aplicar a cola histo acral. Primeiro, puxe vários capilares finos.

Em seguida, conecte uma ponteira de pipeta de 1,5 mililitro a um pequeno tubo plástico com cerca de um trinta e dois avos de polegada de diâmetro. Inserindo a extremidade menor no tubo, conecte uma capilar com sua abertura larga à outra extremidade. Após a montagem, carregue a capilar com cola histológica mergulhando a capilar em uma gota de cola e fazendo uma leve sucção através da ponteira plástica.

Ao trabalhar com a cola, deve-se ter um segundo capilar de vidro à mão para remover o excesso de cola da ponta do capilar de cola. A cola permanece líquida até entrar em contato com solução salina tamponada, quando então endurecerá em alguns segundos. No entanto, geralmente permanece plástica por tempo suficiente para ser removida da ponta do capilar de cola ou durante sua aplicação ao espécime.

Agora, para iniciar a imobilização das larvas, coloque uma gota de cola histo acral próximo a cada canto do syl guard. Adicione lâminas de cobertura e 50 microlitros de tampão B e B nas gotas de cola, que endurecerão instantaneamente; preencha o espaço entre os pontos colados com B e B. A cola manterá o tampão sobre a lâmina.

Pegue uma larva L3 vagante e coloque-a sobre um pedaço de papel-toalha úmido sobre gelo por dois minutos. Isso diminuirá seu movimento. Em seguida, transfira a larva para o tampão e posicione-a com o lado dorsal voltado para cima.

Este é o lado das larvas que não possui os cintos idênticos. Aplique rapidamente um pouco de cola entre a região da cabeça e o protetor de soleira. A cola endurecerá muito rapidamente e impedirá que a cabeça das larvas se mova.

Usando pinças, segure cuidadosamente o animal pelos espinhos posteriores e estique-o suavemente. Fixe as larvas nesta posição aplicando cola ao longo dos dois lados da larva na metade posterior. Para reduzir movimentos adicionais da cutícula pelos músculos da parede corporal, adicione mais cola nas laterais do animal.

A larva está agora fixada nesta posição. A lamínula pode ser colocada em um pequeno recipiente de Petri contendo hemolinfa artificial ou PBS, e as pulsações cardíacas podem ser registradas sem interferência dos movimentos da parede corporal. O coração de *Drosophila* semi-intacto baterá ritmicamente por horas após a dissecação, desde que mantido em hemolinfa artificial fresca e oxigenada.

Um exemplo representativo é mostrado aqui e no filme suplementar um, corações de larvas de terceiro estágio em estrela mostrados aqui e moscas jovens, de uma a três semanas após a eclosão, geralmente exibem uma frequência cardíaca regular entre um e três hertz. Moscas com mais de três semanas geralmente são mais arrítmicas. No entanto, esses corações ainda são capazes de pulsar espontaneamente por horas em hemolinfa artificial oxigenada. Corações e moscas adultas danificados como resultado do procedimento de dissecação tipicamente apresentam regiões localizadas de constrição extrema que são incapazes de relaxar e muitas vezes se contraem de forma descontrolada. Frequências cardíacas mais lentas que um hertz raramente são observadas em moscas com menos de três semanas de idade.

Consequentemente, essas preparações são consideradas danificadas e são descartadas. Acabamos de demonstrar como preparar corações de moscas-das-frutas adultas em nível adequado para imagem óptica. Lembre-se, ao fazer a preparação semiconectada, nunca toque diretamente no coração.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.