Uma técnica para Simultaneamente Visualize-Virus específicos células T CD8 + e células infectadas por vírus In situ

Ao combinar hibridização in situ e coloração com tetrâmero em uma técnica conhecida como ISTH, podem ser determinados os números relativos e as relações espaciais entre células efetoras imunes específicas para antígenos virais e células e tecidos infectados pelo vírus. O ISTH começa com a inclusão de tecido infectado pelo SIV em agarose. O tecido é cortado em secções de 200 mícrons de espessura usando um vibrátomo e corado para antígeno viral.

Células CD8+ específicas utilizando tetrâmeros de MHC marcados com fit C. Após congelamento, esses cortes corados são cortados em seções de oito micrômetros de espessura usando um criostato e é realizada hibridização in situ para localizar células infectadas pelo vírus. A microscopia confocal é utilizada para imagens das seções duplamente coradas e, por fim, reconstruir as seções espessas originais para revelar a relação entre células efetoras imunes e células-alvo.

O uso deste procedimento para examinar a infecção precoce pelo SIV revelou-se um bom preditor da gravidade da doença subsequente. Olá, sou Chinen Lee do laboratório de Ashley HA do Departamento de Microbiologia da Universidade de Minnesota. Sou Pam Skinner, professora assistente do Departamento de Ciências Biomédicas Veterinárias da Universidade de Minnesota.

Hoje vamos mostrar a vocês um procedimento para hibridização in situ no instituto, ou ISTH, abreviadamente. Além de usar a coloração com tetramero in situ combinada com hibridização in situ, conforme estamos demonstrando hoje, também utilizamos rotineiramente a coloração com tetramero in situ combinada com imunohistoquímica para determinar a localização, abundância e perfil de expressão proteica de linfócitos T CD8+ específicos para antígenos in situ. Nos auxiliando hoje na coloração com tetramero in situ em cortes espessos estarão o Dr. Heon Kim e Terry Matala, e nos auxiliando na preparação de cortes finos e na hibridização in situ estará. Vamos começar.

Para iniciar este procedimento, resfrie o banho de Vibram contendo PBSH estéril até cerca de dois graus Celsius. Ajuste o ângulo da lâmina do vibratomo para 27 graus. Sempre que possível, mantenha os tecidos frescos resfriados em gelo e inicie o procedimento dentro de 24 horas após a coleta dos tecidos.

Para minimizar a degradação pelo resfriamento, o vibram também facilita o corte de um tecido fresco, remova o tecido conjuntivo e corte o espécime com bisturi em pequenos pedaços, coloque os pedaços em um molde de inclusão e cubra com agarose a 4% de baixo ponto de fusão em PBS, derretida a aproximadamente 40 graus Celsius. Certifique-se de que o tecido esteja em contato com o fundo do recipiente e empurre os pedaços de tecido para baixo caso flutuem; solidifique em gelo por três a cinco minutos.

Aqui está sendo usado tecido de baço, mas linfonodo, vagina, colo do útero, útero ou outros tecidos frescos também podem ser usados com um bisturi. Corte os agros ao redor do tecido e, usando pinça, transfira cuidadosamente o tecido com agros embutidos para o bloco de tecido. Prossiga revestindo um bloco de tecido Vibram com cola Loctite.

Não mova o pedaço de tecido uma vez que ele esteja posicionado no bloco de tecido. Deixe secar por cerca de 10 minutos sobre gelo. Em seguida, monte o bloco de tecido no vibrátomo e corte o tecido em seções com espessura de 200 micrômetros, utilizando uma velocidade de avanço muito lenta e amplitude relativamente alta.

Use um pincel para transferir as seções cortadas para uma câmara de tecido especializada colocada no poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços previamente preenchida com um mililitro de PBSH gelado. Coloque até quatro seções de tecido em cada câmara de tecido. Identifique as amostras e fixe a tampa à placa com uma borracha para que as seções de tecido sejam coradas para linfócitos T específicos pelo vírus.

Os tetraméricos conjugados com ZI são primeiro diluídos em tampão bloqueador para cerca de 0,5 microgramas por mililitro. A solução é pipetada em uma placa de 24 poços, com um mililitro por poço. O tecido recém-cortado é transferido para a placa nas câmaras de tecido e mantido em agitação durante a noite a quatro graus Celsius.

Mantenha um poço vazio entre as câmaras de tecido contendo amostras diferentes para evitar contaminação cruzada das soluções nas etapas subsequentes. Nesta etapa, é possível adicionar anticorpos direcionados contra proteínas extracelulares ou da superfície celular. Para a lavagem, prepare uma placa de cultura de tecidos de 24 poços contendo PBSH gelado após a incubação primária.

Lave duas vezes transferindo as câmaras de tecido para uma placa pré-preenchida por 20 minutos cada vez, certificando-se de drenar a maior parte do líquido das câmaras de tecido antes da transferência. Além disso, evite gotejar o conteúdo de uma amostra em outra ao mover as câmaras de tecido e observe atentamente as seções nas câmaras para garantir que não fiquem presas às laterais. Fixe as seções com paraformaldeído fresco a 4% em PBS por duas horas à temperatura ambiente após a fixação.

Lave duas vezes com PBSH frio por cinco minutos cada vez para amplificar o sinal dos tetrameros. Incube as seções com anticorpos anti-fitzy de coelho na proporção de um para 10.000 em tampão bloqueador por um a três dias. Nesta etapa, pode-se adicionar anticorpos contra epítopos intracelulares.

Certifique-se de permeabilizar as células e bloquear os sítios inespecíficos antes da adição do anticorpo. Pode ser necessário também realizar a recuperação de antígenos após a segunda incubação prolongada, destinada a amplificar o sinal. Lave as seções em PBSH três vezes, por pelo menos 20 minutos e até várias horas cada vez.

Realize uma incubação final com anticorpos apropriados marcados com fluoróforos. Por exemplo, pode-se usar anticorpo secundário de cabra anti coelho SI três para ligar os anticorpos de coelho anti fitzy e fazer as células marcadas com o tetramero fluorescerem em vermelho. Se anticorpos de camundongo forem usados para contra-coloração de proteínas de interesse, como CD oito para visualizar as células T citotóxicas, pode-se usar anticorpo secundário de cabra anti camundongo Alexa 488 para se ligar aos anticorpos de camundongo e fazer as células marcadas com o anticorpo fluorescerem em verde. As diluições de cada anticorpo devem ser determinadas empiricamente.

Incube por um a três dias, mantendo as seções protegidas da luz envolvendo as placas com papel-alumínio durante esta incubação e posteriormente, pois a luz quencha as florações. Por fim, fixe novamente as seções para assegurar os tetrameros e os anticorpos em seus lugares. Lave e monte em lâmina de microscópio com gelatina glicerolada contendo quatro miligramas por mililitro de N-profilgalato para armazenamento a menos 20 graus Celsius até o preparo de cortes finos para hibridização in situ.

As seções coradas com tetrâmero in situ podem agora ser analisadas com um microscópio confocal para determinar a localização, abundância e padrão de expressão proteica de linfócitos T CD8+ específicos para antígeno. Na imagem mostrada, seções de tecido esplênico de um macaco Rhesus infectado com o vírus da imunodeficiência símia (SIV) foram coradas com tetrâmeros Gag para marcar linfócitos T CD8+ específicos para SIV, além de anticorpos contra CD20 e CD3. Como a coloração de contraste com anticorpos será perdida na próxima etapa, é importante analisar os tetrâmeros in situ antes de prosseguir.

Inicie o procedimento de corte fino aquecendo as seções com 200 mícrons de espessura a 70 graus Celsius por cinco minutos em um bloco de aquecimento, a fim de destacar as seções espessas da lâmina. Uma vez que as seções estejam destacadas, incorpore-as em OCT sobre gelo seco, preenchendo primeiro o fundo do molde plástico com OCT. Em seguida, coloque o tecido sobre o OCT e cubra-o com OCT.

Use um criostato para cortar seções de oito mícrons de espessura a partir das seções embutidas em OCT e adere as seções de oito mícrons a lâminas silanizadas. As lâminas podem então ser armazenadas a menos 80 graus Celsius em uma caixa lacrada para hibridização in situ subsequente. A hibridização in situ padrão é utilizada para detectar células infectadas viralmente por meio de sondas de riboprobes específicas para o vírus marcadas com S 35.

O procedimento também inclui o revestimento dos cortes com emulsão de rastreamento nuclear e a montagem de lâminas. Em um meio paramount compatível com fluorescência, imagens confocais são adquiridas usando um microscópio confocal BioRad MRC 1000, equipado com um dispositivo de reflexão azul no tubo epi. A coloração com tetramero in situ é visualizada usando o EPI 1 605 para o fluoróforo vermelho do tetramero e o EPI 2 522 DF 32 para o fluoróforo verde do CD8 para hibridização in situ.

Utilize a reflexão azul EPI para identificar os grãos de prata resultantes do sinal de hibridização in situ nos autorradiogramas revelados. Para iniciar a aquisição de imagens, capture as imagens de cada seção da esquerda para a direita e de cima para baixo, garantindo que cada imagem tenha uma sobreposição de aproximadamente 20% com as imagens vizinhas. Para evitar lacunas na imagem montada reconstruída, nomeie cada imagem de acordo com sua linha e coluna em um arquivo Excel.

Quando a coleta de dados das lâminas estiver concluída, utilize o software assistente de microscopia confocal para projetar as imagens Z seriadas de cada canal em uma única imagem, usando um procedimento do Photoshop com sete etapas disponível com os autores, e mesclar automaticamente a imagem projetada dos três canais em uma única imagem RGB. Em seguida, una as imagens mescladas em camadas para gerar uma imagem em mosaico de toda a seção. Associe grãos de prata individuais e a coloração por tetramérico às células na imagem em mosaico utilizando o Metamorph ou o Photoshop.

Atribua as coordenadas XY dos centros ou OID das células positivas para RNA viral e positivas para tetramero. Exporte os dados de OID para arquivos Excel como números numéricos para cada célula e use os dados coletados nos arquivos Excel para determinar as proporções de células efetoras imunes ou células e em relação aos alvos virais ou células T, a partir dos números totais de células positivas para tetramero e positivas para RNA viral na seção, a fim de capturar as relações espaciais entre as células positivas para tetramero e as células positivas para RNA. Copie e cole seus respectivos gráficos dos arquivos Excel em um documento do Photoshop no Photoshop.

Diminua a opacidade de uma camada para alinhar e dimensionar as grades de modo que coincidam em cor, selecione e, em seguida, copie e cole em uma nova camada. As posições das células positivas para RNA azul descartam a camada usada para alinhar as grades, e as posições das células positivas para tetramérico e para RNA viral positivo serão reveladas na imagem aplanada. Utilizando o método ISTH mostrado aqui, somos capazes de acompanhar a resposta imune à infecção pelo SIV após inoculação intravaginal nessa porta de entrada e nos tecidos linfáticos para os quais a infecção se espalha.

Existem grandes quantidades de células infectadas nesses sítios teciduais aos 10 dias pós-infecção, mas, mesmo três dias depois, há células positivas para a coloração verde do CD A, mas ainda não há células positivas para o tetramero específico para SIV com coloração vermelha. A resposta imune é, portanto, tardia demais para eliminar a infecção.

No entanto, três semanas após a infecção, uma diminuição nas células infectadas é claramente visível, especialmente no portal de entrada. Utilizamos ISTH para demonstrar que a extensão da redução foi correlacionada com a proximidade espacial e os números relativos de células efetoras imunes positivas para o tetramero. Células-alvo positivas para N-S-I-V-R-N-A, chamamos de razão E para T in vivo.

As relações espaciais são facilmente visualizadas usando este método, com células efetoras em vermelho e alvos virais em azul neste linfonodo infectado. Muitas células efetoras e alvo estão em estreita proximidade, e há áreas onde várias células efetoras cercam uma única célula positiva para S-I-V-R-N-A, enquanto em outras áreas uma célula positiva para S-I-V-R-N-A permanece isolada. A razão de ETT é simplesmente calculada conforme as posições das células são determinadas e registradas pelo número de cada uma no arquivo Excel.

O melhor controle da infecção viral correlaciona-se com um grande excesso de efetores vermelhos sobre alvos verdes, numa proporção de 43 para um. Neste caso, no colo do útero e na vagina, onde a infecção começou, as proporções E:T foram menores nos linfonodos. A correlação positiva entre altas proporções E:T e a redução da carga viral a partir do pico indica que uma resposta imune mais robusta na porta de entrada se traduz em um melhor controle da infecção.

Acabamos de mostrar como detectar simultaneamente as células CDAT muito específicas e as células infectadas pelo vírus in situ. Esta técnica nos permite visualizar simultaneamente células T específicas para antígenos e células infectadas pelo vírus nos tecidos. Esta técnica pode ser aplicada para avaliar a vacina baseada em células T positivas para CD8 e outras interações entre patógenos e hospedeiros não relacionadas a valor ao realizar este procedimento.

É importante manter todos os reagentes livres de RNAses antes da hibridização. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.