Um método rápido de alta capacidade para Ribonucleoproteínas Mapping (RNPs) no pré-mRNA Humanos

Para mapear os sítios de ligação de proteínas ribonucleares em pré-mRNAs, comece por cobrir a região designada do pré-mRNA de interesse em janelas de 30 nucleotídeos e sintetize os oligos em mosaico em um arranjo. Os oligos são removidos por fervura do arranjo e coprecipitados com um RNP de interesse. O pool inicial total é marcado com SCI três e o pool ligado é marcado com SCI cinco, e ambos são aplicados no arranjo de detecção.

O arranjo é então escaneado e o software de extração de características é utilizado para interpretar os resultados. Sais. Olá, sou Kate Watkins do laboratório de Will Fair brother no Departamento de MCB da Universidade Brown. Hoje vou mostrar a vocês um procedimento rápido e econômico para determinar a localização precisa de um complexo proteína-RNA no pré-mRNA no laboratório, re-sintetizando o pré-mA como um pool de oligonucleotídeos sobrepostos.

Esse pool pode então ser separado em uma fração ligada e uma não ligada por coimunoprecipitação e, em seguida, analisado por meio de um microarranjo. Embora este procedimento tenha diversas aplicações, utilizamo-lo para estudar múltiplos fatores de splicing e seu papel no splicing alternativo. Vamos então começar.

Para iniciar este procedimento, utilize o navegador de genoma uc SC para baixar genes específicos, junções de splicing ou outras regiões de interesse a partir das quais será projetado o pool de prem A. Selecione as janelas de interesse e, em seguida, organize-as computacionalmente com um comprimento de leitura de 30 nucleotídeos e uma sobreposição de 20 nucleotídeos, de modo que cada oligo seja deslocado em 10 nucleotídeos em relação ao anterior. Agora que os oligos de 30 nucleotídeos de comprimento estão definidos, flanqueie cada um com sequências universais de iniciadores.

Envie os oligos à Agilent para impressão em um microarranjo de oligonucleotídeos personalizado. Assim que o microarranjo chegar, inicie a recuperação dos oligos de DNA de sua superfície colocando a lâmina de cobertura do arranjo em uma câmara de hibridização e pipetando suavemente 500 microlitros de água desionizada sobre a lâmina. Coloque a lâmina do microarranjo com a face voltada para baixo sobre a lâmina de cobertura, de modo que as etiquetas de cada lâmina fiquem voltadas uma para a outra, tomando cuidado para evitar bolhas de ar que possam interromper o processo de recuperação dos oligos.

Feche a câmara de hibridização e gire-a durante a noite a 99 graus Celsius em uma estufa de hibridização. No dia seguinte, remova cuidadosamente a matriz da câmara e retire a água, que agora contém os oligos liberados da superfície da matriz. Coloque o pool de oligos liberados em um tubo einor de 1,5 mililitro e sonique para quebrar possíveis aglomerados, com amplitude de 50%, três vezes, com pulsos de três a cinco segundos cada vez. Em seguida, amplifique o pool por PCR de poucos ciclos utilizando primers universais com um promotor T acrescentado em sua extremidade.

O número de ciclos necessários pode variar dependendo da eficiência da recuperação do oligo. Evite a superamplificação, que é visível como uma faixa difusa em um gel de acrilamida. Por fim, utilize o kit mega short script da Amon para transcrever o RNA.

Finalize a reação de transcrição por meio da extração do RNA com cloreto de fenila e clorofórmio, seguida de precipitação com etanol utilizando acetato de sódio e também azul de glicerol como carreador. Redissolva o pellet de RNA em 105 microlitros de tampão TE. Para determinar com precisão a concentração do RNA.

Utilize ribo green para gerar uma curva padrão. Em seguida, realize a medição usando um leitor de placas de fluorescência. O pool de RNA está agora pronto para iniciar a coimunoprecipitação e o pull down.

Primeiro, prepare as microesferas magnéticas combinando microesferas Dyna de proteína A e proteína G em uma proporção de um para um, até um volume final de 50 microlitros por reação. Concentre as microesferas em um único local utilizando um suporte magnético para separação, a fim de remover o sobrenadante. Em seguida, lave duas vezes com volume igual de PBS 1X frio após a segunda lavagem.

Resuspenda as microesferas em volume igual de PBS 1x frio e adicione dois nanogramas do anticorpo por íon. Esta quantidade pode variar dependendo do anticorpo, portanto pode ser necessário realizar experimentação para determinar as condições ideais para ligação do anticorpo às microesferas. Incube a mistura durante a noite a quatro graus Celsius em plataforma rotatória.

No período da manhã, adicione dois microgramas por reação de RNA total de levedura sonicado para bloquear a ligação inespecífica e incube em rotação por mais 30 minutos a quatro graus Celsius. Após a conclusão do passo de bloqueio, utilize novamente o suporte magnético para remover o sobrenadante. Em seguida, lave as microesferas duas vezes com PBS 1× frio, deixando o PBS da segunda lavagem no tubo, e alíquota 50 microlitros da mistura de microesferas em novos tubos.

Um tubo para cada reação de co-IP. As esferas estão agora prontas para a co-IP. Em seguida, prepare a mistura mestra combinando o pool de oligonucleotídeos de RNA com o extrato nuclear de células.

Como fonte de RNP, retire uma alíquota de 50 microlitros da mistura mestra como proteção total da amostra. Os iniciadores, que são versões de RNA dos iniciadores universais, podem ser adicionados para evitar a ligação de proteínas à sequência do iniciador ou a introdução de estrutura secundária ao RNA. Para iniciar a coimunoprecipitação, remova o sobrenadante das alíquotas de esferas e re suspenda as esferas em 120 microlitros da mistura mestra restante. Agite suavemente as reações a quatro graus Celsius por uma a duas horas.

No final da incubação, uma pequena alíquota de Eloqua, incluindo as microesferas, pode ser removida de cada co-ip. Para testes adicionais de eficiência ou especificidade de ligação, coloque o restante das reações no ímã e remova o sobrenadante. Em seguida, realize uma a duas lavagens com XPDS frio.

O RNA ligado ao anticorpo nas microesferas por meio do RNP é a amostra de IP. Re-suspenda as microesferas de IP em 50 microlitros de SDS 1% em tampão XTE 0,1X e aqueça as amostras a 65 graus Celsius por 15 minutos. Para eluir o RNA, remova o sobrenadante, que agora contém o RNA previamente ligado às microesferas, e purifique por extração com fenol-clorofórmio, seguida por precipitação com etanol; re-suspenda o precipitado em 50 microlitros de tampão XT 0,1X.

Em seguida, realize a transcrição reversa das amostras utilizando os iniciadores universais reversos. Em seguida, amplifique as amostras por PCR com os iniciadores universais, sendo que um deles deve conter um promotor T sete. O número de ciclos necessário para amplificar o pool dependerá da eficiência do co-ip.

Utilizando o kit de script de mega shorts da Ambion, transcreva as amostras novamente, mas desta vez adicione dois microlitros de UTP aminoalila em vez do UTP T7 fornecido com o kit. O UTP aminoalila será usado posteriormente para marcar o RNA com os side eyes. Quando a transcrição estiver concluída.

Extraia os amostras com clorofórmio fenílico e precipite com etanol. Não utilize glicoblue ou acetato de amônio, pois podem interferir na hibridização das amostras ao arranjo. Ressuspenda o precipitado em 4,5 microlitros de carbonato de sódio 0,1 molar.

Para rotular primeiramente as amostras, adicione 2,5 microlitros de água livre de nucleases à amostra total. Adicione três microlitros de S3 à amostra de IP e três microlitros de SCI cinco. Incube no escuro por uma hora.

À temperatura ambiente, interrompa a reação adicionando seis microlitros de hidroxilamina 4 M HCl a cada amostra, misture bem e centrifugue. Incube brevemente por 15 minutos à temperatura ambiente e purifique as amostras marcadas por extração com fenol-clorofórmio, seguida de precipitação com etanol. A maior parte da cor é transferida para a fase orgânica junto com os nucleotídeos livres, portanto, os pellets podem não apresentar coloração visível.

Re-suspenda cada pellet em 50 microlitros de 0,1 XTE. Siga as instruções do kit de hibridização de microarranjo da Agilent para preparar a amostra de microarranjo, com a seguinte exceção: não fragmente o RNA; após adicionar o tampão de fragmentação, adicione imediatamente o tampão de hibridização para interromper a fragmentação.

Coloque as amostras na matriz e hibridize a 50 graus Celsius por três horas enquanto a matriz estiver em rotação. Prepare as seguintes soluções de 50 mililitros em tubos cónicos de 50 mililitros: um tubo de tampão SC com dois volumes em excesso, dois tubos de tampão SEA com um volume em excesso e um tubo com água desionizada.

Após a incubação de três horas, desaperte cuidadosamente o conjunto do lâmina do arranjo e coloque-o no tampão 2XSSC. Usando um par de pinças, separe suavemente o arranjo da lâmina de cobertura.

Remova cuidadosamente a lamínula, tomando cuidado para não tocar o arranjo. Ao retirar a lâmina, feche o cônico e inverta suavemente por 60 segundos. Usando a pinça, transfira o arranjo para a solução de XSSC 1x.

Tampe o tubo e inverta suavemente por um minuto. Em seguida, transfira a lâmina para a segunda solução XSSC e, novamente, inverta suavemente por mais um minuto. Por fim, transfira a lâmina para o tubo contendo água desionizada e inverta suavemente por 30 segundos.

Seque o arranjo colocando as bordas da lâmina sobre um lenço de papel absorvente. Continue girando o arranjo sobre o lenço, tomando cuidado para não perturbar o lado que contém os oligonucleotídeos. Coloque o arranjo em um tubo cônico vazio e prossiga para escanear o arranjo.

Prossiga para escanear a matriz. Abaixo há uma matriz representativa. Cada local ou oligonucleotídeo é colorido em verde, representando o pool total não enriquecido, ou em vermelho, representando o pool enriquecido por IP.

O sinal em cada característica é normalizado pela intensidade total naquele canal. A saída final é a razão logarítmica do canal vermelho sobre o canal verde. Em cada característica da matriz, a pontuação média em cada coordenada genômica é mapeada para a localização dada.

Uma ilustração deste passo de média é apresentada para três oligonucleotídeos sobrepostos de 30 nucleotídeos com pontuações de dois, quatro e 0,5, onde a pontuação média de enriquecimento para cada janela de 10 nucleotídeos é mostrada. Aqui há um exemplo de um esquema de ligação da proteína de ligação de polipirina PTB no gene CLTA; as características do gene são apresentadas ao longo da parte inferior e as pontuações médias logarítmicas de enriquecimento para os fragmentos ligados ao PTB são representadas por barras verticais vermelho-escuras. Barras vermelho-claras indicam regiões não enriquecidas para ligação ao PTB.

Acabo de mostrar como criar rapidamente e com eficiência um pool de oligonucleotídeos que cobre regiões de interesse, como éxons alternativamente esplicados. Analisamos nossos pools por microarranjo, mas também é possível sequenciá-los por meio de sequenciamento Illumina, sequenciamento Lexi ou sequenciamento Sanger mais tradicional. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a criação do pool pode sofrer modificações tanto no nível de RNA quanto no nível de proteína.

No nível do RNA, podemos introduzir regiões autólogas, mutações associadas a doenças, polimorfismos ou mutações aleatórias na sequência do oligonucleotídeo. No nível da proteína, o fator de ligação ao RNA pode ser modificado por fosforilação ou outras modificações pós-traducionais. Além disso, o ambiente de ligação pode ser manipulado para aumentar ou diminuir os níveis de fatores adicionais que competem com ou interagem com a proteína de ligação ao RNA de interesse.

Assim sendo, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.