Medir coeficientes de difusão através de dois fótons de fluorescência de Recuperação Após Fotodegradação

A fluorescência multifotônica. A recuperação após o clareamento fotônico é facilmente demonstrada com uma amostra livremente difusível de moléculas de corante fluorescente. Primeiro, um feixe a laser de baixa intensidade é direcionado à amostra para gerar um nível de referência de fluorescência a partir das moléculas D dentro do volume focal do laser.

Em seguida, um breve pulso de laser de alta intensidade é aplicado para fotobranquear uma porção das moléculas do corante dentro do volume focal. Por fim, o feixe de laser é atenuado ao nível de baixa intensidade anterior e a fluorescência é monitorada à medida que as moléculas fotobranqueadas difundem-se para fora e são substituídas por moléculas ainda fluorescentes provenientes de fora do volume focal. A curva resultante da fluorescência em função do tempo é analisada para determinar o coeficiente de difusão.

Olá, sou Kelly Sullivan do Laboratório de Edward Brown, do Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade de Rochester. Hoje vamos mostrar como realizar a recuperação de fluorescência por múltiplos fótons após fotobranqueamento. Utilizamos esta técnica em nosso laboratório para estudar a difusão em sistemas biológicos in vitro e in vivo.

Então vamos começar. Para iniciar, defina o comprimento de onda do laser desejado e insira o filtro apropriado diante do tubo fotomultiplicador ou PMT. Em seguida, para evitar danos à célula pcal, ajuste a potência do laser para 200 miliwatts ou menos.

Existem dois espelhos orientados em formato de quatro upstream da célula pcal. Esses espelhos são necessários e suficientes para alinhar o feixe do laser através da célula pcal. Ajuste a tensão de deslocamento no controlador de polarização da célula pcal para zero e ajuste o trajeto do laser através da célula pcal de modo que o laser esteja centralizado nas janelas frontal e traseira.

Use o espelho montante na figura quatro para centralizar o feixe na janela frontal e o espelho jusante na figura quatro para centralizar o feixe na janela traseira. Agora, ajuste a tensão sobre o cristal da célula pcal ao valor máximo. O valor apropriado depende do comprimento de onda e pode ser encontrado no manual de instruções da célula pcal.

Ajuste os espelhos na figura quatro a montante da célula pcal até que a potência de saída da célula pcal seja maximizada. Agora, comute a tensão sobre o cristal para zero e ajuste a tensão de deslocamento no controlador de polarização para minimizar a potência de saída da célula pcal. Restaure a potência do laser incidente na célula pcal ao valor necessário para o experimento.

Agora, movendo-se para o microscópio, obtenha um bom foco visual em uma amostra fluorescente padronizada. Aqui estamos utilizando grãos de pólen fluorescentes fixados. Após o foco, feche o microscópio e ajuste a potência do laser a um nível apropriado para a imagem da amostra, alterando a tensão no cristal da célula pcal.

Por fim, desligue as luzes e ligue o PMT. Inicie uma varredura de imagem repetida da amostra padronizada e ajuste os espelhos a jusante da célula pcal até obter uma imagem nítida da amostra. Agora vamos analisar como determinar as potências seguras de monitoramento com foco dentro da amostra.

Para fins deste vídeo, usaremos uma amostra de corante aquoso contida em uma depressão de uma lâmina de vidro e selada com uma lamínula. Atenuar o laser para uma potência baixa, mas razoável, capaz de gerar fluorescência na amostra. Fechar o microscópio e desviar a saída do PMT para o contador de fótons.

Desligue as luzes, ligue o PMT e inicie uma varredura pontual no software do microscópio. Configure o contador de fótons para integrar em uma escala de tempo muito maior que o tempo esperado de recuperação da fluorescência e registre um número razoável de pontos de dados. Aumente a potência e obtenha outra série de dados de contagem de fótons.

Continue aumentando a potência até que o aumento na contagem de fótons pareça diminuir significativamente. Em relação ao gráfico de aumento de potência, o logaritmo da contagem de fótons em função do logaritmo da potência. Qualquer desvio em relação a uma inclinação de dois indica fotobranqueamento.

Durante o monitoramento, selecione uma potência de monitor adequada que esteja abaixo desse valor de corte. Agora vamos determinar os parâmetros de entrada do escalonador multicanal e do gerador de pulsos. No gerador de pulsos.

Defina o tempo de pré-ensino como sendo uma a duas vezes maior que o tempo esperado de meia recuperação e o tempo de clareamento como sendo um décimo do tempo esperado de meia recuperação no escalonador. Defina a largura do canal (bin) como aproximadamente metade da duração do clareamento e defina o número de canais por registro, de modo que o produto entre a largura do canal selecionada e o número de canais por registro seja maior que o tempo esperado de recuperação completa. Adicione os tempos de pré-clareamento e de clareamento e retorne ao gerador de pulsos, ajustando a frequência da sequência de pré-clareamento e clareamento para um valor ligeiramente inferior ao inverso do produto entre a largura do canal e o número de canais por registro.

Por fim, ajuste o número de registros por varredura no escalonador com base na intensidade do sinal na potência de monitoramento escolhida. Agora, defina a potência de monitoramento para um nível seguro e ajuste a potência de branqueamento para cerca de 200 miliwatts acima do limite de corte de branqueamento determinado durante o teste de branqueamento de monitoramento. Essas potências são ambas definidas como tensões diferentes através do selo de cristal da célula al, o microscópio desliga as luzes.

Ligue o PMT. Inicie uma varredura pontual no software de imagem. Em seguida, inicie o gerador de pulsos e o escalador.

Para analisar a curva de recuperação resultante, marque três pontos importantes: a fluorescência pré-branqueamento, a fluorescência imediatamente após o branqueamento e a fluorescência no final do conjunto de dados. Utilize os valores de fluorescência pré e imediatamente pós-branqueamento para estimar melhor o tempo de meia-recuperação.

Agora, utilize as regras descritas nas etapas anteriores para atualizar os valores das durações de pré-bleach e largura do pulso inicial. Obtenha uma nova curva e continue ajustando os parâmetros até que a curva resultante exiba um bleach acentuado e uma recuperação suave. Verifique a saturação de excitação plotando o logaritmo do parâmetro de profundidade de bleach em função do logaritmo da potência.

Qualquer desvio em relação a uma inclinação de dois indica saturação de excitação. Escolha uma potência de branqueamento que produza um branqueamento forte, mas que não cause saturação. Por fim, com os parâmetros apropriados determinados, continue obtendo curvas de recuperação de fluorescência após fotobranqueamento multiphotônico ou curvas MP FP da sua amostra de interesse.

Agora mostraremos resultados representativos de ambos os dados brutos de FRAP de MP e uma curva normalizada de F MP que foi ajustada ao modelo teórico. O coeficiente de difusão exibido pelos dados brutos de F MP em FRAP apresenta um forte branqueamento e uma recuperação suave. Com a recuperação completa sendo relatada na segunda metade dos dados para ajustar o modelo. Primeiro normalizamos a recuperação à fluorescência média pré-branqueamento e, em seguida, realizamos um ajuste por mínimos quadrados não lineares.

Com relação ao modelo apropriado, ambos os conjuntos de dados foram obtidos em fluoresceína aquosa e fornecem coeficientes de difusão. Conforme a literatura, acabamos de mostrar como realizar um experimento de recuperação de fluorescência por múltiplos fótons após fotobranqueamento.

Ao realizar este procedimento, é importante ter cuidado ao definir os parâmetros experimentais, em particular a duração do branqueamento e as potências de branqueamento e monitoramento, dentro dos limites seguros definidos no protocolo. Então, obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.