Fabricação e operação de uma inserção de oxigênio para culturas de células aderentes

O dispositivo com inserção hipóxica possui seis pilares que se encaixam nas cavidades de uma placa de seis poços. O gás flui através da rede microfluídica na base do pilar e pode difundir-se pela membrana de PDMS permeável a gases, separando a rede gasosa e o meio de cultura. Este dispositivo minimiza o comprimento do caminho de difusão entre a fonte de oxigênio, a rede microfluídica na base do pilar e as células, permitindo uma equilibração mais rápida da concentração de oxigênio.

O dispositivo também permite um controle muito maior sobre o padrão espacial de oxigênio ao qual as células são expostas, o que é determinado pelo design da rede gasosa microfluídica, feito por meio de fotolitografia padrão utilizando máscaras fotográficas. Olá, sou Sean Ard do laboratório do Dr. David Edington, do Departamento de Bioengenharia da Universidade de Illinois em Chicago. Olá, sou Ellie, também do Laboratório Edington.

Hoje vamos mostrar como fabricar, validar e utilizar um dispositivo personalizado para expor culturas celulares in vitro em uma placa de seis poços a diferentes concentrações de oxigênio. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar o efeito do oxigênio na cicatrização de feridas, na geração de espécies reativas de oxigênio e na migração celular. Então, vamos começar.

Para iniciar a fabricação do inserto oxigenador, prepare o polimetilsiloxano ou PDMS em uma proporção de 10 para 1 entre o pré-polímero e o agente de cura. De acordo com as instruções do fabricante, a mistura de PDMS é adicionada a um molde usinado previamente em formato de Dell ran, padronizado para imitar a forma de uma placa de cultura de seis poços. Após cura a 75 graus Celsius durante a noite, a matriz de pilares replicada resultante formará o primeiro dos três componentes que compõem o inserto oxigenador, com o objetivo de fabricar o segundo componente principal do inserto oxigenador.

Um molde mestre de SU-8 é preparado inicialmente centrifugando o SU 8 21 50. Sobre uma pastilha de silício, aplica-se uma máscara fotolitográfica à pastilha e o SU-8 é exposto à radiação UV através da máscara fotolitográfica para criar um molde mestre com uma espessura de microcanal de 300 micrômetros. Despeje PDMS sobre o molde mestre de SU-8 e cure por duas horas a 75 graus Celsius para obter um molde positivo, que acabará formando os microcanais na base de cada pilar.

O terceiro componente do dispositivo é fabricado por meio da centrifugação de PDMS em uma lâmina de silício a 500 RPM por 10 segundos, seguido de 900 RPM por 30 segundos, para obter uma membrana cerebral com espessura de 100 micrômetros. Como o PDMS é permeável a gases, o oxigênio pode ser fornecido diretamente aos microcanais através desta membrana. Uma vez que todos os componentes estão prontos, cada superfície de ligação é submetida a um tratamento com plasma de oxigênio por um minuto.

Usando um dispositivo de plasma portátil, primeiro una os seis componentes do microcanal ao arranjo de pilares; em seguida, perfure dois orifícios em cada pilar para servir como entradas e saídas de gás. Por fim, una a membrana à base do microcanal para facilitar a ligação e remover quaisquer bolhas. As superfícies tratadas com plasma são pressionadas juntas por cerca de um minuto usando a extremidade achatada de uma pinça; aguarde uma hora entre cada ligação para garantir que o dispositivo esteja completamente unido e possa ser calibrado.

Uma vez que um dispositivo completo tenha sido fabricado, o nível de oxigênio recebido pelas células ao utilizar o inserto oxigenador em experimentos reais precisa ser calibrado. Para a calibração, use um sensor fluorescente de oxigênio ou lâmina foxy, que contém um revestimento fluorescente de rutenio cuja fluorescência é atenuada pelo oxigênio. As lâminas foxy são pré-cortadas para se encaixarem no fundo de uma placa de seis poços.

O suporte de aço deve ser cortado para cobrir o máximo possível da superfície do poço. Como o suporte de aço tem uma espessura de cerca de um milímetro, modifique o dispositivo para manter a distância desejada para uma difusão adequada da membrana.

Essa distância depende do experimento, mas na maioria dos casos deve ser inferior a um milímetro utilizando o dispositivo de plasma manual para unir um microscópio de vidro com corte de um milímetro de espessura. Fixe postes de aproximadamente seis milímetros de comprimento e quatro milímetros de largura na parte inferior do dispositivo. O dispositivo repousará sobre os postes localizados na parte superior do corte do porta-objetos.

Lâminas de vidro também podem ser utilizadas para uma lacuna de difusão de 0,17 milímetros para validar o consumo de oxigênio. Adicione três mililitros de água desionizada à temperatura ambiente nos poços de uma placa de seis poços onde o oxigênio será medido. Coloque o dispositivo na placa e, utilizando o software Metamorph, selecione o número e a localização das posições desejadas no sensor Foxy.

Deslize para o ensaio de concentrações de oxigênio. Conecte a tubulação do maçarico ao tanque de gás oxigênio e ao dispositivo de inserção hipóxico. Um regulador de fluxo de precisão ajustado a uma taxa de fluxo de 50 a 100 mililitros por minuto é utilizado para controle fino do gás fornecido.

Certifique-se de que o regulador de fluxo de precisão está fechado. Abra primeiro o regulador superior do tanque, seguido pelo regulador de precisão. Reduza a taxa de fluxo para entre 10 e 20 por minuto após 15 minutos.

Para evitar a formação de bolhas na água, observe atentamente o valor da vazão durante a próxima hora e faça ajustes conforme necessário, pois a queda de pressão mudará enquanto o sistema se equilibra, alterando a vazão para capturar imagens da placa e dos sensores foxy. Utiliza-se um microscópio Olympus IX 71 equipado com fluorescência, uma câmera de dispositivo acoplado à carga da Q Imaging Tiga, SRV e o software de aquisição de imagens Metamorpho. O microscópio está equipado com um filtro fluorescente Olympus 3 1 0 2 0, compatível com foxy, com comprimento de onda de excitação de 475 nanômetros e comprimento de onda de emissão de 600 nanômetros.

Para testar o tempo de equilíbrio e a extensão de oxigenação do dispositivo, escolha três pontos no lâmina foxy nos quais medir a concentração de oxigênio. Capture uma imagem da lâmina imediatamente antes de iniciar o fluxo de gás. Capture imagens em intervalos de 10 segundos durante 30 minutos enquanto o gás flui através do dispositivo para testar a heterogeneidade e a entrega de oxigênio.

Estabeleça múltiplos pontos em intervalos de um milímetro ao longo da largura do canal e meça a concentração de oxigênio na superfície do poço utilizando o Metamorph. Exporte a intensidade média da imagem para cada posição e trace a concentração de oxigenação em função da intensidade de fluorescência. Gere uma curva de calibração ajustando curvas lineares à linha de 0 a 10% e à linha de 10 a 21%, relacionando a intensidade de fluorescência à concentração de oxigênio. Para cada posição medida, os dados brutos de intensidade podem ser exportados do Metamorph e analisados posteriormente com o Microsoft Excel ou outro software estatístico.

Uma vez que o dispositivo tenha sido calibrado, experimentos como ensaios de cicatrização podem ser iniciados. Autoclave o inserto calibrado a 121 graus Celsius por 15 minutos até 24 horas antes do experimento e manipule-o em uma câmara de fluxo laminar para prevenir contaminação subsequente. Mergulhe o inserto de PDMS esterilizado em meio livre de soro por 24 horas para inibir a formação de bolhas de gás ao inseri-lo nos poços da placa. Cultive células MDCK ou outras células aderentes até 100% de confluência em uma placa de seis poços e crie arranhões lineares nas monocamadas com uma ponteira de pipeta P200. Os arranhões simulam feridas na monocamada aderente.

Aspire o meio celular sem perturbar a monocamada e enxágue com cinco mililitros de meio. Aspire novamente e reabasteça os poços com três mililitros de meio sem soro. Insira suavemente o dispositivo na placa, certificando-se de evitar bolhas.

Inclinar o dispositivo durante a inserção ajuda a expelir bolhas por um dos lados. Tenha cuidado para evitar aplicar pressão excessiva sobre o dispositivo, o que poderia deformar o PDMS o suficiente para esmagar as células subjacentes. Coloque a placa e o dispositivo sobre uma platina de microscópio aquecida a 37 graus Celsius e conecte as tubulações do tanque de gás de origem às portas de entrada e saída do dispositivo.

O incubador de cultura deve possuir um orifício para permitir a entrada de tubos, e os tubos devem ser conectados. Após colocar o dispositivo no incubador, siga o mesmo procedimento descrito anteriormente para iniciar o fluxo de gás, capture imagens em intervalos regulares das células a cada 20 minutos durante 15 a 18 horas, utilizando o equipamento e o software de imagem descritos anteriormente. Um algoritmo de medição de ferida em T pode ser usado para analisar a área não cicatrizada após a duração experimental desejada. Interrompa o fluxo de gás, remova a placa e prossiga com o processamento adicional das células, se desejado. O dispositivo com inserção hipóxica requer menos de dois minutos para estabilizar em 0,5% de oxigênio, conforme mostrado aqui.

O tamanho do espaço entre o fundo do poço e a membrana do dispositivo foi um fator crítico na determinação da eficiência de equilíbrio, com tamanhos maiores de espaço exigindo mais tempo para atingir valores estáveis de concentração de oxigênio. O dispositivo também permite um grande controle sobre a oxigenação espacial em um único poço, possibilitando a formação de múltiplas condições e até gerando um perfil cíclico de oxigênio ao longo da superfície do poço. Monocamadas de células MDCK foram expostas a 10% ou 21% de oxigênio e a área superficial da lesão foi analisada ao longo do tempo utilizando o algoritmo de rastreamento de ferimento por arranhão do MATLAB Ts.

Após 11 horas de um total de 17 horas, 6,87% da ferida original permaneceu quando exposta a 10% de oxigênio, enquanto 64,4% da ferida permaneceu sob 21%. Como mostrado aqui, as concentrações de oxigênio apresentam correlação negativa com a área aberta da ferida para ambas as concentrações de oxigênio. Durante toda a duração do experimento, mostramos como fabricar, validar e utilizar o dispositivo com inserção hipóxica para um ensaio de cicatrização de ferida por arranhão. O dispositivo oferece diversas vantagens em comparação com outros sistemas de oxigenação, como menor espaço ocupado em laboratório e controle muito maior sobre a oxigenação espacial e temporal na superfície celular.

O dispositivo pode ser utilizado por praticamente qualquer laboratório que estude o efeito do oxigênio ou de outros gases, como o dióxido de carbono, sobre culturas celulares in vitro. Ao realizar este procedimento, é importante deixar o dispositivo esterilizado e os meios de cultura em imersão durante a noite, minimizar a formação de bolhas durante o experimento. Além disso, é necessário permitir que o sistema atinja o equilíbrio antes de iniciar o experimento.

Isso ocorre porque a taxa de fluxo muda conforme a pressão no sistema se equilibra. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.