Robótica e Análise de Imagem Dinâmica de Estudos de Expressão Gênica em Tecidos Vegetais

Neste procedimento, a dinâmica da expressão gênica em tecidos vegetais é registrada por imagens ao longo do tempo com o uso de robótica; primeiramente, sementes de feijão-de-lima são esterilizadas e colocadas entre toalhas de papel umedecidas em um recipiente de cultura de tecidos para germinação. Após quatro dias, os cotilédones são removidos e bombardeados com uma construção de DNA contendo um promotor fundido ao GFP. Os cotilédones colocados em placas de Petri são montados em um sistema robótico personalizado de coleta de imagens bidimensional. O robô é programado para capturar imagens de cada fragmento de tecido a cada hora durante 100 horas.

As imagens são submetidas à análise de imagem, gerando dados quantitativos sobre a intensidade da expressão de GFP ao longo do tempo. Olá, sou John Finer, diretor do Laboratório de Transformação de Plantas do Departamento de Horticultura e Ciência de Culturas da Universidade Estadual de Ohio. Sou Carlos Herandez Garcia, estudante de doutorado no laboratório Finer da Universidade Estadual de Ohio.

Hoje Carlos mostrará o protocolo que desenvolvemos para análise da expressão gênica e de tecidos vegetais utilizando a proteína verde fluorescente. Utilizamos este procedimento desenvolvido em laboratório para medir a atividade da cepa de OD. Para isso, nosso primeiro promotor está localizado a montante do gene GFP, que são nossos genes repórter.

Vou mostrar como introduzimos o controle do promotor na veia da folha de feijão-de-lima e enviamos um aplicativo em nosso sistema robótico personalizado de captura de imagens. Finalizarei revisando nosso protocolo para análise de imagens. Vamos começar: esterilize superficialmente as sementes de feijão-de-lima utilizando procedimentos padrão.

Coloque as sementes esterilizadas em recipientes Magenta GA7 entre camadas de papel-toalha úmido e incube-as por quatro dias a 25 graus Celsius. Aqui, utilizamos um vetor de expressão de alto número de cópias, útil para análises de promotor e elementos promotores. Este vetor contém o gene GFP, que é usado para visualizar a função do promotor ou elemento promotor em tecidos transformados cerca de uma a duas horas antes da bombardeamento.

Excise o CU de feijão-lima da casca das sementes. O CU de feijão-lima adequado para bombardeio deve ser amarelo a verde claro, plano e livre de qualquer dano que possa interferir na análise subsequente de imagens; imediatamente após a excisão, coloque 12 CUs em uma placa de Petri com meio de cultura OMS contendo sais MS, vitaminas B5, 3% sacarose e 0,2% gelrite, ajustado a pH 5,7. Em seguida, precipite o construto de DNA sobre partículas de tungstênio M-10. Primeiro, logo antes do uso, re-suspenda as partículas em água estéril até uma concentração de 100 miligramas por mililitro.

Em seguida, em um tubo fuge de 0,6 mililitro, adicione 25 microlitros de partículas, cinco microlitros de DNA a um micrograma por microlitro, 25 microlitros de cloreto de cálcio 2,5 molar e 10 microlitros de espermina 100 milimolar. Incube a preparação de DNA no gelo por cinco minutos, depois remova e descarte 50 microlitros da solução que está acima das partículas. Re suspenda as partículas revestidas com DNA que permanecem no fundo do tubo por meio de vortex.

E imediatamente após a agitação em vórtex, retire dois microlitros de Eloqua. Repita este passo de agitação em vórtex. Toda vez que um Eloqua for removido, as partículas revestidas devem ser mantidas em gelo e utilizadas dentro de 15 minutos.

Agora que o DNA está revestido nas partículas, coloque dois microlitros de partículas através da parte superior de um filtro de seringa no centro de uma tela de filtro. Em seguida, coloque o filtro de seringa na unidade de suporte do filtro dentro da câmara do canhão de influxo de partículas ou câmara PIG. Coloque um feijão-de-lima com a extremidade axial voltada para cima sobre uma chapa defletora, que consiste em uma tela soldada na base de um béquer.

Coloque a placa defletora, que é usada como uma plataforma para sustentar os tecidos durante a bombardeamento na câmara da arma de partículas. Para bombardear o tecido, abra primeiro a válvula que conduz ao vácuo para esvaziar a câmara. Quando o vácuo atingir 760 milímetros de mercúrio, ative o solenoide e libere o hélio para propelir as partículas.

A pressão de hélio utilizada para acelerar as partículas é de 50 a 60 PSI. Após a bombardeamento com partículas, feche a válvula da linha de vácuo e libere o vácuo usando a válvula de exaustão. Quando o vácuo for liberado, abra a porta da câmara para recuperar o co leadin bombardeado e devolva o co leadin para o lado dal.

Até o meio de cultura OMS para quantificação e perfilagem de expressão. Bataca minuciosamente três co líderes para cada construto de DNA. Um controle positivo, que fornece um perfil bem estudado de expressão gênica, também é incluído.

Os porta-objetos com as amostras estão agora prontos para a aquisição de imagens. Ligue a lâmpada de mercúrio e aguarde 30 minutos para que a lâmpada aqueça completamente. Ligue as fontes de alimentação para a câmera SPOT R-T-C-C-D e para o controlador do motor, que comanda o movimento da plataforma robótica personalizada, a qual sustenta oito placas.

Configure o conjunto de filtros para detecção de GFP selecionando o conjunto de dois filtros para GFP com excitação em 480 nanômetros e emissão em 510 nanômetros em um microscópio estereoscópico MZ L três. Em seguida, esterilize as tampas espessas de policarbonato dos recipientes de Petri borrifando com etanol a 70%. As tampas especiais utilizadas para cobrir a base do recipiente de Petri evitam a condensação durante a aquisição das imagens.

Coloque as placas contendo cuan bombardeado na plataforma de robótica e aperte o parafuso lateral de fixação para prendê-las na posição. Agora, abra o aplicativo personalizado que controla tanto a plataforma de robótica quanto a aquisição de imagens. Abra também o interruptor do controlador de luz branca no software e oriente a plataforma para a posição inicial.

Isso é feito antes de inserir as posições. Para cada entrada de coddle na guia do motor, selecione a primeira placa. A plataforma posicionará o centro da placa de Petri sob o objetivo do microscópio.

Utilizando os botões de distância de movimentação, posicione com precisão o primeiro CU LEADIN para a coleta de imagens. Usando o recurso de modo ao vivo, mova o cuddle leaden para a área de visualização apropriada. Para o primeiro cuddle leaden, use os botões manuais do microscópio estereoscópico para ajustar o foco e defina a ampliação para 1,6 x. Uma vez que a região de interesse tenha sido definida, clique no botão adicionar esta posição.

O software adicionará as coordenadas dessa região a um arquivo de programação de posições e a plataforma retornará ao centro das posições definidas para todos os coens restantes nas placas. Usando os botões de distância de movimento, utilize os três parafusos manuais de nivelamento localizados abaixo de cada placa na plataforma robótica para ajustar o foco para o coan restante na mesma placa. Após todas as coordenadas de todos os coans terem sido inseridas, salve as coordenadas do agendamento de posições.

Insira os parâmetros de aquisição de imagens, como o tipo de luz, que é azul para GFP, e a configuração de exposição, além de especificar onde armazenar as imagens conforme descrito no protocolo escrito. Acesse a guia de controle de tempo de captura e defina o intervalo de tempo de aquisição de imagens e o número total de ciclos de coleta de imagens. As imagens são tipicamente coletadas a cada hora durante 100 horas.

Geração de perfis bem definidos de expressão gênica. Inicie a aquisição de imagens abrindo a guia de programação de posições e, em seguida, clicando no botão executar programação. Isole o sistema de coleta de imagens da luz ambiente ao final da coleta de imagens de 100 horas.

As imagens de alta resolução, com cerca de cinco megabytes cada, estão prontas para análise de imagem. Utilize o Image Ready para montar as 100 imagens sequenciais de cada pasta. Importe todas as imagens sequenciais como quadros e redimensione-as para 800 por 600 pixels para acelerar o processamento de imagem.

Em seguida, utilize marcas em uma nova camada introduzida, que é visível em todos os quadros, usando os pontos selecionados de GFP como referência na imagem. Alinhe manualmente cada imagem; quando o alinhamento estiver completo, exclua a camada usada como referência e salve o arquivo como um único arquivo PSD. Além disso, exporte todos os quadros como um único arquivo MOV usando a resolução mais alta.

Os arquivos agora estão prontos para iniciar a quantificação de GFP. Utilize o ImageJ para abrir o arquivo MOV e recorte uma área de 400 por 300 pixels. Em seguida, separe as imagens sequenciais em canais vermelho, azul e verde utilizando a ferramenta de separação RGB para os canais vermelho e verde.

Subtraia a fluorescência de fundo utilizando a ferramenta de plugin subtrair ROI medida para cada fatia. Calcule a expressão de GFP ajustando os níveis de limiar e utilizando um plugin projetado para medir o valor médio de escala de cinza por pixel e o número total de pixels que expressam GFP. Copie os valores de saída no ImageJ. Finalmente, cole os valores de saída para os canais verde e vermelho no Microsoft Office.

Excel para manipulação adicional dos dados, a fim de dar uma ideia dos resultados do alinhamento de imagens. Esta primeira animação mostra a imprecisão na reposicionamento da plataforma robótica durante o experimento de 100 horas. O movimento dos pontos é um artefato resultante da incapacidade da plataforma robótica de retornar exatamente à mesma posição em cada ponto temporal após o alinhamento manual das imagens; as células que expressam GFP podem ser facilmente observadas e as características únicas deste sistema de rastreamento são visualizadas com clareza.

À medida que esta animação se repete, observe as células que expressam GFP e estão circuladas; a célula circulada em vermelho mostra uma diminuição muito rápida na expressão entre 18 e 20 horas após a bombardeamento, enquanto a célula circulada em branco mostra um início tardio da expressão de GFP. Além das animações, este procedimento permite a quantificação rápida da expressão de GFP ao longo do tempo no tecido-alvo de feijão-de-lima. Esses resultados representativos mostram a quantificação comparativa da intensidade de promotores utilizando o promotor CAMV 35S e quatro promotores diferentes de soja.

Acabamos de mostrar como introduzir DNA no catalin de germinado. As sementes da veia Lima colocam o catalin no robô, coletam imagens para análise de imagem e analisam essas imagens. Utilizamos rotineiramente este procedimento em nosso laboratório para validar promotores de plantas clonadas.

Pode-se gerar uma grande quantidade de dados a partir da introdução de diferentes promotores vegetais. No entanto, este procedimento é complicado e possui muitas etapas que podem falhar; ao realizar este procedimento, é importante começar com sementes frescas de feijão-fava ou, pelo menos, usar sementes de alta qualidade que tenham sido armazenadas adequadamente. Também é importante colocar rapidamente a tampa cortada do porta-objetos no robô e utilizar a tampa grossa da placa de Petri para minimizar problemas de condensação.

E por último, observe que a GFP que utilizamos é outra versão chamada SGFP, proveniente do Gen HIN Lab da Universidade de Harvard. Essa GFP não é muito estável e pode ser mais adequada para acompanhar alterações rápidas na expressão gênica. E é isso por enquanto, obrigado por assistir.

E boa sorte com seus experimentos.