Fluxo multicolor de Citometria de Análises de resposta imune celular em macacos rhesus
22 de abril de 2010
Demonstramos a utilidade da multicolor citometria de fluxo para caracterização fenotípica e funcional detalhada do total, bem como subconjuntos memória de CD4 + e CD8 + T em macacos rhesus, o modelo ideal para estudos de HIV / AIDS vacina.
Este vídeo demonstra um procedimento para estimular e corar células mononucleares do sangue periférico ou pbmc. Para análise de citometria de fluxo multicolorida, Alec Watts de pbmc isoladas de sangue total são colocadas em placas de cultura de tecidos. As células são estimuladas química ou biologicamente para produzir uma resposta imune.
Após a estimulação, um coquetel de anticorpos é adicionado para identificar os tipos celulares com base nos marcadores de superfície expressos. As células são então permeabilizadas e um coquetel diferente de anticorpos é adicionado para detectar a expressão de citocinas intracelulares; em seguida, as células são analisadas por citometria de fluxo para determinar os perfis de citocinas em subconjuntos específicos de PBMC. Olá, sou Amy Courtney do laboratório do Dr. Jagan SAS, do Departamento de Imunologia do Centro de Câncer MD Anderson da Universidade do Texas.
Olá, eu sou a Hong, também do laboratório. Hoje vamos mostrar a vocês uma análise de multicitometria das respostas de linfócitos T. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar respostas imunes celulares em Reus Maca.
Então vamos começar. Inicie este protocolo utilizando um hemocitômetro para determinar as contagens de células viáveis de pbmc de Reuss Maca pelo método de exclusão com corante Azul de Tripano. Trabalhando em uma cabine de fluxo laminar reus.
Suspenda as células em meio completo na concentração de 10 milhões de células por mililitro para estimulação não específica, adicionando 100 microlitros da suspensão celular em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços. Em seguida, adicione 100 microlitros de meio contendo PMA e CIN para atingir um volume total de 0,2 mililitros, com concentração final de 50 nanogramas por mililitro de PMA e 500 nanogramas por mililitro de CIN; para os poços de controle negativo, adicione 100 microlitros de meio completo apenas a cada poço. Incube as células a 37 graus Celsius em atmosfera úmida com 5% de dióxido de carbono após 1,5 hora.
Adicione a felden A ao cultivo numa concentração final de 10 microgramas por mililitro e incube por mais 4,5 horas. A felden A é adicionada para aprisionar citocinas no aparelho gold G, aumentando a visibilidade com coloração imunológica; após a estimulação, centrifugue para remover o meio e, em seguida, lave adicionando 200 microlitros de tampão de lavagem frio para fluxo, e centrifugue em baixa velocidade. Repita essa lavagem, depois ressuspenda em 50 microlitros de tampão de lavagem para fluxo.
As células estão agora prontas para serem coradas para expressão de marcadores de superfície em cada poço das células re-suspensas. Adicione um microlitro do corante fluorescente fixável aqua viável-morto preparado de acordo com as instruções S do fabricante. Incube a quatro graus Celsius no escuro por 30 minutos enquanto as células estão em incubação.
Prepare as soluções de coloração que serão usadas para os fatos em tubos micro. Primeiro, prepare um coquetel de estoque para incluir os seguintes componentes adequadamente. Anticorpos monoclonais marcados com fluorescência titulados, anti-CD3 PE SCI7, anti-CD8 Alexa 700, anti-CD28 perCP SCI 5.5, anti-CD95 APC e anti-CD4 Pacific Blue no tampão de lavagem Inflow.
Em seguida, prepare controles de compensação, que serão utilizados para determinar os coeficientes de vazamento de cada corante individual para outros detectores, preparando um tubo com cada anticorpo conjugado fluorescentemente individualmente como coloração monocromática. Por fim, prepare colorações de fluorescência menos um ou FMO combinando todos os reagentes, exceto o de interesse. Isso será utilizado para determinar o limite entre uma população positiva e negativa, duplicando os níveis de autofluorescência e os dados presentes em amostras totalmente coradas.
Após as células terem sido incubadas no corante vivo-morto, lave-as uma vez com tampão de lavagem frio para fluxo para remover o corante em excesso e aspire o tampão de lavagem. Em seguida, adicione as soluções de coloração preparadas. Incube as células a quatro graus Celsius, no escuro, por 30 minutos.
Lave as células coradas com tampão de lavagem frio para fluxo para remover o excesso de anticorpo. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução de fixação e permeabilização BD por pelo menos 10 minutos. Armazene as células a quatro graus Celsius, no escuro, por até 24 horas, até o seu uso, ou prossiga para a marcação das citocinas intracelulares.
Primeiramente, permeabilize as células em 100 microlitros de perm um X. Lave o tampão e incube por 10 minutos a quatro graus Celsius no escuro enquanto as células estão em incubação. Prepare os anticorpos de marcação, controles de compensação e controles FMO no tampão de lavagem um X como anteriormente.
Após a incubação das células por 10 minutos, centrifugue e remova o tampão de permeabilização 1X. Adicione os anticorpos de marcação apropriados. Em seguida, incube as células e os anticorpos por 60 minutos a quatro graus Celsius, no escuro, após a incubação.
Lave as células duas vezes com a solução de permeabilização. Após a lavagem final, ressuspenda as células em paraformaldeído a 1% em DPBS para fixar as células. Armazene as células a quatro graus Celsius, no escuro, até o uso, durante um período máximo de 24 horas.
Uma vez que as células tenham sido coradas, utilize um citômetro de fluxo LSR dois ou um citômetro de fluxo Cyan AD para realizar as análises. Em seguida, analise os dados utilizando o FlowJo ou software similar. A composição de PBMC em Maca reuss foi determinada usando análise de citometria de fluxo.
Esta figura mostra o esquema de seleção utilizado para a análise dos diferentes subconjuntos de linfócitos T de um animal representativo. Os linfócitos foram inicialmente selecionados por dispersão para frente (FSC) versus dispersão lateral (SSC) e, em seguida, os linfócitos viáveis foram identificados com base na população negativa para SSC e AQUA. As células T foram então identificadas pela expressão de CD três; as populações CD quatro positivo, CD oito negativo e CD quatro negativo CD oito positivo foram também determinadas dentro da população de células T positivas para CD três.
Os linfócitos T CD4 positivo e CD8 positivo foram ainda diferenciados em diferentes subpopulações com base na expressão de CD28 e CD95 como células de memória central, memória efetora e naïve. Esta figura mostra a produção de interferon gama e IL-2 em linfócitos T CD4 positivo não estimulados e estimulados com PMA e ionomicina, bem como em suas subpopulações.
Observe os perfis distintos de citocinas provocados pela estimulação. Em cada subconjunto. Temos de mostrar como realizar a análise de citometria de fluxo múltipla de pbmc.
Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de preparar os controles de compensação de cor única e os controles de fluorescência menos um. Ambos esses controles são necessários para uma análise adequada dos dados de citometria de fluxo. Consulte o nosso protocolo escrito para obter mais informações sobre a escolha dos controles de compensação.
Além disso, lembre-se de que, ao usar anticorpos marcados com fluorescência, é importante cobrir as amostras para protegê-las da exposição à luz. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este vídeo demonstra um procedimento para estimular e corar células mononucleares do sangue periférico (PBMC) para análise por citometria de fluxo multicolorida. O estudo foca na caracterização fenotípica e funcional de subpopulações de linfócitos T CD4+ e CD8+ em macacos-ruivos, um modelo para pesquisa de vacinas contra HIV/AIDS.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Citometria de Fluxo
- Pesquisa sobre HIV/AIDS
Antecedentes
- Macacos-ruivos são usados como modelo para o estudo do HIV/AIDS.
- O entendimento dos subconjuntos de células T é essencial para o desenvolvimento de vacinas.
- A citometria de fluxo multicolor permite uma análise detalhada das células imunes.
- Os PBMCs são componentes-chave no estudo das respostas imunes.
Objetivo do Estudo
- Caracterizar subconjuntos totais e de memória de linfócitos T.
- Utilizar citometria de fluxo multicolor para perfilhamento imune detalhado.
- Aprimorar a compreensão das respostas imunes no contexto do HIV/AIDS.
Métodos Utilizados
- Isolamento de PBMC a partir de sangue total.
- Estímulo químico ou biológico de PBMCs.
- Uso de coquetéis de anticorpos para identificar tipos celulares e marcadores de superfície.
- Análise de perfis de citocinas utilizando citometria de fluxo.
Resultados Principais
- Estimulação e coloração bem-sucedidas de PBMCs para análise.
- Identificação de subconjuntos específicos de linfócitos T com base em marcadores de superfície.
- Caracterização da expressão intracelular de citocinas.
- Informações sobre respostas imunes relevantes para HIV/AIDS.
Conclusões
- A citometria de fluxo multicolor é eficaz para a análise de linfócitos T.
- Os macacos-ruivos fornecem informações valiosas para a pesquisa de vacinas contra o HIV.
- Compreender a dinâmica dos linfócitos T é essencial para o desenvolvimento de terapias eficazes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A citometria de fluxo multicolor permite o perfilamento fenotípico e funcional preciso de subpopulações de linfócitos T em macacos-ruivos, um modelo pré-clínico essencial para o desenvolvimento de vacinas contra o HIV. Esta abordagem apoia a validação de alvos ao quantificar respostas imunes produtoras de citocinas, orientando decisões de avanço ou interrupção no estágio inicial de descoberta. O método aumenta a confiança preditiva ao associar a estimulação específica de antígenos a saídas mensuráveis de citocinas intracelulares em populações definidas de memória.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a medição da produção de IFN-γ e IL-2 em subpopulações de linfócitos T CD4+ e CD8+ após estimulação.
- Valor Operacional: Fornece medidas qualitativas e quantitativas da expressão intracelular de citocinas para reduzir a ambiguidade mecanicista na validação de alvos imunológicos.
- Valor Científico: Apoia a desoneração biológica por meio da detecção sensível de frações minoritárias de linfócitos T específicos por antígenos em amostras de PBMC de animais vacinados.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho posteriores, estabelecendo protocolos padronizados de coloração e estimulação para perfis imunológicos reprodutíveis.
- Valor Operacional: Aborda a padronização e reprodutibilidade do ensaio mediante o uso de controles de compensação e controles FMO para garantir o direcionamento preciso das populações celulares.
- Valor Científico: Destaca a preparação para triagem ao permitir a detecção de perfis de citocinas em subpopulações de células T naïve, de memória central e de memória efetora.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Discute a relevância para doenças ao correlacionar medições de citocinas intracelulares em macacos-ruivos com a patogênese do HIV e respostas imunes induzidas por vacinas.
- Valor Operacional: Descreve a continuidade do processo, desde a descoberta até a validação pré-clínica, ao associar os resultados da estimulação de PBMCs à caracterização funcional de linfócitos T.
- Valor Científico: Enfoca o valor preditivo de redução de riscos, utilizando a produção de citocinas como leitura funcional para avaliação da imunogenicidade de vacinas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se posiciona dentro do continuum de descoberta, desde o perfil imunológico inicial até a identificação de candidatos promissores, apoiando a verificação de hipóteses e a clarificação de vias em modelos de doenças infecciosas.
- Biologia da Descoberta: Explica como o método apoia o teste de hipóteses ao quantificar a produção de citocinas em subconjuntos específicos de linfócitos T após estimulação com PMA/ionomicina ou estímulo específico por antígeno.
- Triagem: Descreve a prontidão do ensaio por meio de estimulação padronizada, coloração de superfície e intracelular e análise citométrica de fluxo de amostras de PBMC.
- Análises: Destaca medições como as frequências de produção de IFN-γ e IL-2, que permitem a comparação de respostas imunes entre diferentes condições e subconjuntos.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o método com a continuidade pré-clínica ao vincular as respostas de linfócitos T induzidas por vacinas em macacos-ruivos a perfis imunológicos funcionais relevantes para o desenvolvimento de vacinas contra o HIV.
- Reutilização Empresarial: Apresenta o método como uma capacidade reutilizável para monitoramento imunológico longitudinal entre diferentes candidatos a vacinas e formulações de adjuvantes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista em respostas imunes mediadas por linfócitos T.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade de ensaios de citometria de fluxo multicolor para perfilhamento imunológico.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais eficazes sobre avanço ou interrupção de projetos, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em fases avançadas de programas de desenvolvimento de vacinas.
- Impacto sobre o Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco, com base em perfis quantitativos de citocinas em modelos pré-clínicos.
Considerações sobre a Implementação
- Expertise científica necessária no design de painéis de citometria de fluxo, compensação e estratégia de seleção de eventos para imunofenotipagem multicolorida.
- Necessidades de instrumentação e infraestrutura analítica, incluindo citômetro de fluxo (por exemplo, LSR II) e software (por exemplo, FlowJo) para análise de dados de alta dimensionalidade.
- Requisitos de padronização entre equipes para condições de estímulo, titulação de anticorpos e configuração de controles (cores únicas e FMO) entre laboratórios.
- Considerações de adaptação entre sistemas modelo, incluindo otimização das concentrações de estímulo e tempos de incubação para PBMC de primatas não humanos.
- Limitações práticas apoiadas pelo material de origem: necessidade de proteção contra a luz para anticorpos fluorescentes e titulação cuidadosa para minimizar o derramamento em painéis multicoloridos.
