Determinação da Reatividade e Titre de soro usando um ensaio de hemaglutinação

Determinação da reatividade e título do soro utilizando um ensaio de hemaglutinina. Uma reação de precipitação é uma reação que ocorre entre anticorpos solúveis e antígenos particulados. Estes podem incluir células ou moléculas carreadoras.

Epítopos na superfície do vetor permitem que um anticorpo se ligue e promova a ligação cruzada do vetor, levando à formação de uma rede complexa denominada complexo antígeno-anticorpo. A hemaglutinação é uma forma específica de aglutinação na qual anticorpos se ligam aos glóbulos vermelhos, que atuam como antígenos particulados. Os glóbulos vermelhos são alvos úteis, pois são facilmente disponíveis e os resultados podem ser visualizados facilmente a olho nu.

As amostras de soro são diluídas em série e, em seguida, colocadas em uma placa ubo de 96 poços. Uma suspensão de células vermelhas do sangue, células Riva, é então adicionada. Quando anticorpos presentes em alta concentração se ligam às hemácias, forma-se uma grande rede tridimensional.

À medida que essa rede se sedimenta pela gravidade, ela se adapta ao formato da placa ubo. Quando vista de cima, observa-se uma camada ampla de hemácias. Esta é uma reação positiva de hemaglutinação.

Quando os níveis de anticorpos são baixos, nenhuma rede pode se formar e as hemácias assumem a forma da placa UBO e se concentram na base, formando um pequeno pellet. Esta é uma reação negativa de hemaglutinação. Este diagrama mostra uma reação positiva.

As células formam uma rede enquanto sedimentam, adaptando-se ao formato da placa com fundo em U. À esquerda e à direita, vemos a vista superior, onde é observada uma camada ampla de hemácias. Se houver uma quantidade intermediária de anticorpos presentes, será observada alguma formação de aglutinação.

A hemaglutinação também permite testar a reatividade de diferentes amostras de soro contra o antígeno conhecido. O título do soro também pode ser determinado. O título corresponde à última diluição na qual foi observada uma reação positiva.

Normalmente, quanto maior a concentração de anticorpos na amostra de soro, maior o título. Este diagrama mostra uma reação negativa de hemaglutinação. Quantidade insuficiente de anticorpos presente para promover a ligação cruzada entre as hemácias.

À medida que as células sedimentam pela gravidade, deslizam pela parede do poço, formando um pellet compacto no fundo. O diagrama à direita mostra as hemácias quando vistas de cima. Para este experimento, você precisará de 1 placa de fundo redondo de 96 poços.

É essencial o uso de uma placa com fundo em U, pois placas com fundo plano não permitirão que as células sedimentem formando um pellet, tornando a interpretação impossível. Um pipetador capaz de dispensar 50 microlitros adiciona soro, uma suspensão a 1% de células Riva e uma solução tampão salina verone a cada poço da linha. De um a 12, adicione 50 microlitros de tampão salino roal.

Isso é usado como seu diluente. Agora coloque 50 microlitros de soro no poço A1. Esta é sua primeira diluição um para dois.

Usando o perpet, certifique-se de que a amostra de soro esteja completamente homogeneizada. Após a homogeneização, retire 50 microlitros do poço A um e transfira para o poço A dois. Esta é a sua segunda diluição um para dois, resultando em uma diluição quatro vezes maior.

Continue esta série de diluições usando os poços de três a 11. Não coloque nenhum soro no poço 12, pois este é o seu controle negativo de solução salina tampão. Agora, pegue sua suspensão a 1% de células de Riva, que foi completamente homogeneizada, e transfira 50 microlitros para o poço A1 até o poço A12.

Uma vez que as células tenham sido adicionadas, cubra a placa e bata suavemente na placa para garantir que as amostras e as células sejam misturadas. Incube agora a 37 graus por 60 minutos. Um incubador umidificado é apropriado.

Durante o período de incubação de 60 minutos, ocorrerão interações entre antígeno e anticorpo e as células começarão a sedimentar. As imagens que você está vendo são uma fotografia com lapso de tempo de todo o período de 60 minutos. Esta é uma ampliação dos poços de cinco a dez.

Já examinamos, bem, o poço 12, que era seu controle VBS neste experimento. As células formaram um pellet compacto, indicando que o ensaio funcionou adequadamente. Os poços cinco e seis são exemplos de hemaglutinação positiva.

Bem, o poço sete é um exemplo de um resultado intermediário de aglutinação, enquanto os poços oito, nove e dez são negativos para hemaglutinação. Com base neste resultado, o título seria determinado com base na diluição do poço sete, já que este foi o último poço em que foi observada uma reação positiva.