Um sistema simples de pontuação Composite Fenótipo para avaliar modelos de ratos de ataxia cerebelar

Desenvolvemos um sistema de pontuação de fenótipo composto para a avaliação da gravidade e progressão da doença. Em modelos murinos de ataxia cerebelar, realizamos quatro testes diferentes: teste da borda, aperto das patas traseiras, marcha e cifose, utilizando uma escala de zero a três para cada teste, resultando em uma pontuação combinada de zero a 12. Entre as quatro medidas, o teste da borda foi realizado para medir diretamente a coordenação.

O fechamento das patas traseiras é um indicador de progressão da doença em diversos modelos de camundongos com neurodegeneração. A marcha é uma medida de coordenação e função muscular. A cifose é a curvatura da coluna na região cervical torácica, comum em modelos de camundongos de neurodegeneração do sistema motor e cerebelar espinhal que realizam cada teste e registram a pontuação.

A soma média dos quatro escores ou o escore médio do fenótipo composto é calculado para cada grupo de camundongos e representado graficamente. Ao aplicar este protocolo a diferentes modelos de camundongos, é importante analisar primeiro os escores dos testes individuais para determinar a combinação ideal das quatro medidas descritas. Este protocolo específico foi desenvolvido para discriminar entre indivíduos afetados e não afetados, além de quantificar a progressão do fenótipo da doença em modelos de camundongos de ataxia cerebelar espinhal.

Tipo sete. Olá, sou Stephanie Fur do laboratório da Dra. Gwen Garden, do Departamento de Neurologia da Universidade de Washington. Hoje vamos mostrar um método simples e sensível para avaliar a gravidade da doença em modelos murinos de ataxia cerebelar.

Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para quantificar diferenças fenotípicas em modelos murinos da ataxia cerebelar espinhal tipo sete ou SCA sete, e para acompanhar a progressão do fenótipo SCA sete ao longo do tempo. Vamos começar. O teste da borda é uma medida direta da coordenação, que é prejudicada nas ataxias cerebelares e em muitos outros distúrbios neurodegenerativos.

Isso mede os sinais mais diretamente comparáveis aos sinais humanos de ataxia cerebelar para evitar viés. O experimentador que realiza as avaliações não deve ter conhecimento sobre o genótipo do animal. Durante as avaliações, cada medida individual é pontuada em uma escala de zero a três, em que zero representa a ausência do fenótipo e três representa sua manifestação mais grave.

Comece levantando o camundongo da gaiola e colocando-o na borda da gaiola. Observe o camundongo enquanto ele caminha ao longo da borda da gaiola e se abaixa de volta para dentro da gaiola. Um camundongo selvagem caminhará ao longo da borda sem perder o equilíbrio e se abaixará de volta para dentro da gaiola com graça, utilizando suas patas.

Esse comportamento recebe uma pontuação de zero. Se o camundongo perder o equilíbrio ao caminhar ao longo da borda, mas de resto parecer coordenado, recebe uma pontuação de um. Se não utilizar efetivamente as patas traseiras ou não conseguir descer suavemente para dentro da gaiola.

Recebe uma pontuação de dois se cair da borda ou quase cair ao caminhar ou tentar descer, ou se tremer e se recusar a se mover completamente. Apesar do estímulo, recebe uma pontuação de três. Realize o teste da borda três vezes para garantir uma medição precisa e registre a pontuação do teste da borda.

Agora vamos ver como pontuar o recolhimento das patas traseiras. O recolhimento das patas traseiras é um indicador de progressão da doença em diversos modelos murinos de neurodegeneração, incluindo certas ataxias cerebelares. Para iniciar a avaliação, segure a cauda próxima à sua base e levante o animal, mantendo-o suspenso acima do objeto mais visível ao redor.

Observe a posição da pata traseira por aproximadamente 10 segundos. Se as patas traseiras estiverem consistentemente abertas para fora, afastadas do abdômen, atribua uma pontuação de zero. Se uma das patas traseiras for recolhida em direção ao abdômen por mais de 50% do tempo suspenso, atribua uma pontuação de um.

Se ambas as patas traseiras forem parcialmente recolhidas em direção ao abdômen por mais de 50% do tempo suspenso, recebe uma pontuação de dois. Se as patas traseiras forem completamente recolhidas e estiverem tocando o abdômen por mais de 50% do tempo suspenso, recebe uma pontuação de três. Realize o teste três vezes e registre a pontuação de recolhimento das patas traseiras.

Agora vamos ver como avaliar a marcha. O teste de marcha é uma medida da coordenação e da função muscular. Para iniciar o teste, retire o camundongo da sua gaiola e coloque-o sobre uma superfície plana com a cabeça voltada para longe do pesquisador.

Observe o camundongo de trás enquanto ele caminha. Se o camundongo se mover normalmente, com o peso do corpo sustentado em todos os membros, com o abdômen sem tocar o solo e com ambos os membros posteriores participando de forma equilibrada, ele recebe uma pontuação de zero. Se apresentar tremor ou parecer mancar ao caminhar, ou se os pés estiverem ligeiramente voltados para fora em relação ao corpo, recebe uma pontuação de um.

Se apresentar um tremor grave, claudicação acentuada, pelve baixa ou os pés apontarem para longe do corpo de forma mais acentuada durante a locomoção, recebe o valor dois. Se o camundongo tiver dificuldade para se mover para frente e arrastar o abdômen pelo chão, recebe o valor três. Observe a GA do camundongo três vezes e registre a pontuação do skate.

Agora vamos ver. O teste de cifose avalia a cifose, que é uma curvatura dorsal característica da coluna vertebral. Essa é uma manifestação comum de doenças neurodegenerativas que envolvem sistemas motores, incluindo as ataxias espinocerebelares em modelos de camundongos.

É causada pela perda do tônus muscular nos músculos espinhais secundária à neurodegeneração. Para começar, retire o camundongo da sua gaiola e coloque-o sobre uma superfície plana. Observe-o enquanto caminha.

Se o camundongo for capaz de endireitar facilmente a coluna vertebral ao caminhar e não apresentar cifose persistente, recebe uma pontuação de zero. Se o camundongo apresentar cifose leve, mas for capaz de endireitar a coluna vertebral, recebe uma pontuação de um. Se não for capaz de endireitar a coluna completamente e mantiver cifose persistente, porém leve, recebe uma pontuação de dois.

Se o camundongo mantiver uma cifose acentuada ao andar ou ao sentar, atribua a ele uma pontuação de três. Observe a pontuação da cifose do camundongo três vezes. Devolva o camundongo à sua gaiola e registre sua pontuação de cifose.

Aqui está um gráfico representativo de uma avaliação do fenótipo composto de um modelo transgênico murino de ataxia espinocerebelar tipo sete conhecido como SCA7 92Q agrupado. Os escores das quatro medidas foram somados para cada camundongo, e o escore composto médio foi calculado para ambos os genótipos em cada idade. Assim, camundongos SCA7 92Q agrupados exibem um fenótipo progressivo de SCA7 que é significativamente diferente dos irmãos não transgênicos. Importante, o aumento do escore fenotípico ao longo do tempo é consistente com a natureza progressiva da doença humana.

Acabamos de mostrar como utilizar um sistema de pontuação de fenótipo composto para avaliar a gravidade e a progressão da doença em modelos murinos de ataxia cerebelar. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a obesidade é um fator de confusão em todos os quatro testes descritos. Os resultados dos testes individuais podem ser analisados separadamente para, inicialmente, determinar sua combinação ideal em um sistema de pontuação de fenótipo composto, mais apropriado para o seu modelo murino.

É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.