Análise do desenvolvimento de um fenótipo morfológico como uma função da concentração de proteínas em levedura de brotamento

Este protocolo utiliza um promotor regulável que permite a expressão controlada de proteínas. Neste experimento, utilizamos um plasmídeo de alta cópia de dois mícrons que expressa o domínio N dois a partir de um promotor reprimível por metionina. Células de levedura selvagens são transformadas com este plasmídeo.

Plasmídeos e transformantes são selecionados em placas sem uol. Após crescimento durante a noite. Em meio seletivo, as células são sincronizadas por interrupção do crescimento mediada pela ausência de cortisol.

Por fim, a expressão é induzida pela transferência das células para meio sem metionina durante o experimento de curso temporal. A concentração proteica é monitorada por meio de western blotting e o desenvolvimento do fenótipo morfológico, por microscopia. Olá, sou Claudia do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Purdue.

Sou de Bari Muji no alar e também no laboratório AL. Hoje vamos mostrar um procedimento para análise do desenvolvimento de um fenótipo morfológico em função da concentração de proteína no corpo indutor. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar os aspectos morfológicos e moleculares de um fenótipo de divisão celular observado após a superexpressão do domínio N dois da proteína adaptadora endocítica ausente dois.

Então vamos começar. Este protocolo inicia-se com a construção de uma linhagem de levedura que expressará sua proteína de interesse. No nosso caso, transformamos a linhagem de levedura selvagem W 3 0 3 com DNA plasmidial de alta cópia que contém o gene nth dois sob o controle do promotor inibível por metionina; dois milimolares de metionina suprimem a atividade do promotor met 25.

Embora o meio sem metionina permita expressão máxima, escolha seis colônias de uma placa contendo células recentemente transformadas e inocule em 50 mililitros de meio seletivo com 0,2 milimolar de metionina em um frasco cônico, incubando durante a noite a 30 graus Celsius com agitação a 200 RPM. Na manhã seguinte, estime a densidade celular medindo a densidade óptica do cultivo a 600 nanômetros. Transfira o equivalente a 20 OD a 600 nanômetros por mililitro de células para um tubo de centrífuga estéril e recolha por centrifugação.

Re-suspenda as células em meio YPD por vortex para sincronizar o ciclo celular até uma concentração final de 15 microgramas por mililitro a partir de um estoque de um miligrama por mililitro em DMSO. Incube por quatro horas a 30 graus Celsius com agitação a 200 RPM. Após quatro horas, verifique a porcentagem de células arrestadas em mitose.

Observando ao microscópio e contando o número de células com brotos de tamanho igual, prossiga para a próxima etapa. Apenas se a arrestação for superior a 90%, colete as células por centrifugação a 2200 RPM durante cinco minutos. Após três lavagens com água gelada, ressuspenda o pellet em meio seletivo sem metionina, com uma densidade celular de aproximadamente 0,5 OD a 600 nanômetros por mililitro.

Transfira metade do volume das células para um novo tubo estéril e adicione metionina até uma concentração final de 0,2 milimolar. Isso servirá como controle para os efeitos devidos aos níveis basais de expressão proteica. Retorne ambas as culturas ao incubador a 30 graus Celsius.

As células são analisadas quanto ao desenvolvimento do fenótipo a cada hora, durante seis horas, em cada momento. Transfira pontualmente um mililitro da suspensão celular de cada cultura para um tubo microcêntrifuga estéril e recolha as células por centrifugação, aspire o sobrenadante e re-suspenda o pellet em 70 microlitros de meio. Em seguida, adicione 30 microlitros de azul de metileno a partir de um estoque de um miligrama por mililitro em água estéril.

Em seguida, pipete cerca de seis microlitros dessa suspensão sobre uma lâmina de vidro limpa e coloque uma lamínula sobre a gota. Pressione suavemente a lamínula para formar uma camada fina e uniforme de células entre as interfaces de vidro. Divida a lamínula em nove quadrantes e capture três imagens por quadrante.

O número de células por campo não deve ser superior a 30 células para permitir uma quantificação precisa. Conte o número de células que apresentam o fenótipo em estudo, que, neste exemplo, são células de levedura brotando com brotos alongados e/ou concatenados que não conseguem se separar um do outro. Também contamos o número de células mortas, identificadas pela sua coloração azul, já que o defeito na divisão celular é induzido após nth.

A superexpressão leva à morte celular para visualizar defeitos fenotípicos específicos em todos os momentos. Retire uma alíquota de um mililitro da cultura em um tubo microcêntrifuga estéril e recolha as células por centrifugação. Suspenda o pellet celular em 100 microlitros de solução de Calcofluor branco a um miligrama por mililitro em água estéril e incube por cinco minutos à temperatura ambiente no escuro.

A coloração com branco de calcio permite a visualização da parede celular. Lave o precipitado três vezes com um volume de PBS. Suspendemos o precipitado final em 100 microlitros de PBS.

Observe as células ao microscópio e adquira imagens em 100 x de magnificação utilizando óptica UV para visualizar a parede celular. Para visualizar septina marcada com GFP, adquira imagens utilizando um filtro FS E. Quantifique a porcentagem de células com defeitos na parede celular e deslocalização de septina utilizando o método mostrado anteriormente, dividindo a lamínula em nove quadrantes e obtendo três imagens por quadrante para contagem no vídeo de lapso de tempo. A microscopia de células individuais de levedura requer leitos de ágar embutidos em meio para a confecção do leito de ágar.

Primeiro, limpe uma lâmina de vidro com depressão côncava usando álcool a 70% e deixe secar ao ar enquanto a lâmina está secando. Ferva 0,06 gramas de agros em cinco mililitros de meio seletivo sem metionina em um forno de micro-ondas até que o agros se dissolva completamente e rapidamente. Pipete 200 microlitros do meio contendo agros na lâmina.

Pressione e inverta outro lâmina de vidro limpa sobre ela, certificando-se de que nenhuma bolha de ar fique aprisionada embaixo. Quando o gel solidificar, mova suavemente a lâmina de cima para longe da lâmina de depressão, mantendo sempre as superfícies paralelas. Isso garante que a superfície do leito de agarose fique nivelada com a superfície da lâmina de depressão.

Limpe a região da lâmina ao redor do leito de agros com um tecido delicado. A lâmina está agora pronta para uso no tempo igual a quatro horas. Transfira um mililitro de células do cultivo para um tubo microcêntrifuga estéril e recolha por centrifugação.

Aspire o sobrenatante e ressuspenda as células em 100 microlitros de meio seletivo fresco sem metionina. Aplique vaselina nas bordas da lamínula. Em seguida, coloque uma gota de suspensão celular no centro do leito de agros e espalhe uniformemente pressionando suavemente uma lamínula sobre ela.

Selar as bordas da lamínula e fixar sua posição aplicando esmalte nas bordas. Após a secagem do esmalte, colocar a lâmina sobre a platina aquecida de um microscópio. Utilizamos um microscópio Zeiss Axio 200 M equipado com uma câmera digital monocromática Zeiss Axio camm, MRM, para escolher um campo que contenha não mais que 10 células adequadamente espaçadas, pois o campo ficará congestionado ao longo do tempo.

À medida que as células se dividem, capture uma imagem do campo a cada cinco minutos durante cerca de cinco horas. Para evitar reajustar o foco repetidamente, programamos o software de aquisição de imagens para adquirir automaticamente algumas imagens de Zack em cada ponto temporal.

A imagem com o melhor foco será selecionada posteriormente para montagem do filme, a fim de garantir calor adequado para as células; uma fonte externa de calor, além dos estágios aquecidos fornecidos por manter a luz branca transmitida do microscópio ligada durante toda a duração da aquisição de imagens, permite que a regressão do fenótipo seja estudada ao montar as imagens em um filme usando o software Image J. Aqui mostramos resultados representativos da superexpressão de nossa proteína de interesse. Nth dois.

Primeiro, a expressão proteica da enésima proteína S2. Durante o período do experimento, lisados de células expressando HA-S2 foram analisados por meio de western blotting utilizando um anticorpo monoclonal anti-HA, conforme mostrado no imunoblot. Células cultivadas na presença de 0,2 milimolar de metionina apresentam expressão proteica mínima. No entanto, células cultivadas em meio sem metionina mostram um aumento constante na concentração de S2 ao longo do período do experimento.

Em seguida, células cultivadas na presença ou ausência de metionina por seis horas foram analisadas, já que uma baixa concentração de nth dois é incapaz de induzir um fenótipo de divisão celular ou morte celular apenas. Uma baixa porcentagem de células está morta, conforme indicado por sua coloração azul após coloração com azul de metileno. Da mesma forma, o número de núcleos por célula, a organização da parede celular e dos septinas são normais, conforme esperado.

Em contraste, a superexpressão de M dois leva a um defeito maciço na divisão celular e à morte celular, conforme demonstrado por longas cadeias de brotos alongados conectados que retêm a cor azul quando corados com azul de metileno. A maioria das células fenotípicas é multinucleada, conforme indicado pela coloração com DPI. A coloração com branco de calco demonstra acúmulos de manchas anormais na parede celular.

Além disso, a septina está fortemente deslocalizada e desorganizada. A quantificação do fenótipo em função do tempo é mostrada neste gráfico, em que os círculos abertos representam zero milimolar de metionina e os círculos fechados representam 0,2 milimolar de metionina. Observamos aqui que, conforme a concentração de nth dois aumenta nas células ao longo do tempo, a porcentagem de células exibindo o fenótipo de divisão celular também aumenta.

Células controle cultivadas em 0,2 mM de metionina mostram que o desenvolvimento do fenótipo é uma função da concentração elevada de proteína e não das condições de cultura celular. Por fim, o desenvolvimento do fenótipo após a superexpressão de Nth2 é registrado por microscopia de vídeo com lapso de tempo.

Após quatro horas de nth, duas células com superexpressão exibem um fenótipo leve de divisão celular morfológica. Conforme o filme avança, observamos períodos anormais e prolongados de crescimento do broto apical, resultando em brotos muito alongados. Também observamos eventos de surgimento de novos brotos antes que um evento de separação celular tenha ocorrido.

Além disso, observa-se que brotos surgem de diversas regiões da célula da mãe, dando origem a uma aparência ramificada. Acabamos de mostrar como caracterizar e analisar o desenvolvimento de um fenótipo morfológico em função da concentração de proteína na levedura brotante. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ressuspender as células nas velocidades de centrifugação recomendadas, pois velocidades mais altas podem danificar as células.

Também é importante lembrar de adicionar azul de metileno e cloreto logo antes da aquisição de imagens, pois são tóxicos para as células light east. Então, obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.