Baseados em DNA Peixe Protocolo Identificação de Espécies

O Sistema de Identificação de Espécies de Peixes é um método simples, rápido e preciso baseado em DNA para identificar as espécies de peixes presentes em uma amostra determinada. As amostras de peixe são tratadas com proteinase K para liberar os ácidos nucleicos em solução. O DNA genômico do peixe é então isolado e amplificado por PCR usando iniciadores que se ligam a sequências encontradas em todos os genomas de peixes.

Os produtos de PCR são então digeridos com três enzimas de restrição diferentes e separados no bioanalisador Agilent 2100. Os comprimentos dos fragmentos gerados nas reações de digestão podem ser utilizados para determinar a espécie de peixe mediante o uso de software de correspondência de padrões de polimorfismo no comprimento dos fragmentos de restrição, ou RFLP. Olá, sou Rachel Formosa da Agilent Technologies.

Hoje vamos mostrar um procedimento para identificação de espécies de peixes baseado em DNA. Este procedimento é um método de triagem que permite identificar as espécies de peixes presentes em amostras frescas, congeladas, moídas, cozidas, secas ou de outro modo processadas. E isso pode ser realizado em menos de um dia de trabalho.

Utilizamos este procedimento para estudar a autenticidade de frutos do mar, o que é muito importante para a indústria pesqueira, pois a substituição e a rotulagem incorreta podem ter consequências econômicas, ambientais e de segurança alimentar significativas. Além disso, pode ser especialmente difícil determinar a espécie de peixe por meio de identificação visual e outros métodos tradicionais. Uma vez que o peixe tenha sido processado, o teste de DNA fornece um resultado muito mais preciso e confiável.

Então vamos começar. Inicie o preparo das amostras para extração de DNA colocando de 10 a 1000 miligramas de cada amostra de tecido de peixe cru ou cozido em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro para cada peixe. Adicione 220 microlitros de solução fresca de proteinase K e pipete para cima e para baixo.

Incube os tubos a 65 graus Celsius por 10 minutos; após a incubação, centrifugue por três a cinco minutos a 14.000 Gs para formar um pellet com quaisquer tecidos não digeridos. Em seguida, transfira cuidadosamente 150 microlitros de cada sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro, evitando qualquer material não digerido no fundo e o material oleoso presente na parte superior. O sobrenadante será agora utilizado para a extração de DNA genômico.

Inicie a extração de DNA genômico adicionando 500 microlitros do tampão de ligação de ácidos nucleicos a cada amostra. Isso elevará o volume total da amostra a 650 microlitros. Vortexe a amostra até homogeneizá-la.

Em seguida, transfira cada amostra para um copo de centrifugação para ligação de DNA, posicionado em um dos tubos receptores de dois mililitros fornecidos no kit. Encaixe a tampa do tubo na parte superior do copo de centrifugação. Centrifugue as amostras por um minuto a 14.000 Gs para carregar o DNA na matriz do copo de centrifugação.

Após a centrifugação, remova os copos de centrifugação, descarte o filtrado e coloque os copos novamente nos tubos receptores. Adicione 500 microlitros de tampão de lavagem com sal em concentração um x. Tampe os tubos e centrifugue novamente após a centrifugação.

Descarte o filtrado e, novamente, coloque os copos de centrifugação nos tubos receptores. Agora, adicione 500 microlitros de etanol a 80%. Tampe o tubo e centrifugue a 14.000 ×g por um minuto.

Repita a lavagem com etanol mais duas vezes após a terceira lavagem em etanol 80%, descartando os filtrados. Substitua os copos de centrifugação nos tubos receptores e, desta vez, centrifugue por dois minutos para secar a matriz de fibras. Agora, transfira os copos de centrifugação para tubos de coleta de 1,5 mililitro.

Adicione 100 microlitros de tampão de evolução a cada copo de centrifugação diretamente sobre a matriz de fibra no interior do copo. Em seguida, encaixe as tampas dos tubos de coleta nos copos de centrifugação e incube-os à temperatura ambiente por um minuto. Após a incubação, centrifugue as amostras em velocidade máxima por um minuto.

Em seguida, descarte o copo de centrifugação e tampe os tubos. Se as concentrações de DNA forem medidas, espera-se valores entre cinco nanogramas por microlitro e 500 nanogramas por microlitro. O DNA pode agora ser armazenado a quatro graus Celsius por até um mês; para armazenamento de longo prazo, coloque o DNA a menos 20 ou menos 80 graus Celsius.

Realize a PCR utilizando os iniciadores e reagentes fornecidos no kit de reagentes P-C-R-R-F-L-P. De acordo com o protocolo escrito fornecido, recomenda-se executar cada amostra, incluindo o controle positivo e o controle sem modelo, em duplicata enquanto a PCR estiver em andamento. Prepare as misturas mestras de enzimas de restrição para as digestões com DTE E um HAE três e NL três combinando os seguintes componentes na ordem indicada: 1,5 microlitros de água destilada estéril, 0,5 microlitros de tampão para enzima 10x e 0,5 microlitros de enzima 10x.

Prepare quantidade suficiente para todas as amostras mais um volume de reação em excesso da mistura de reagentes quatro por três. Em seguida, distribua 2,5 microlitros para cada tubo de reação identificado com o nome da amostra e da enzima. Após a conclusão da PCR, retire as amostras do termociclador e coloque-as no gelo.

Adicione 2,5 microlitros de cada produto de PCR a cada um dos três tubos de digestão com enzima de restrição para essa reação. DDE um HAE três e NLA três. Em seguida, vortex.

Centrifugue brevemente e incube as digestões a 37 graus Celsius por duas horas. Se for mais conveniente, as digestões também podem ser incubadas durante a noite. Após a digestão, incube as reações a 65 graus Celsius por 15 minutos.

Em seguida, adicione um microlitro de EDTA 60 milimolar a cada tubo para encerrar a reação e vortex. Usando o kit de reagentes Agilent Bioanalyzer, prepare e carregue a digestão com restrição nas cavidades de um chip de DNA conforme o guia do kit. Para cada amostra, todos os três digestos devem ser carregados no mesmo chip.

Em seguida, agite o chip em vórtex e carregue-o na máquina. Após a conclusão da corrida, vá ao contexto do ensaio e selecione a aba resumo do chip. No campo nome da amostra, insira um nome de amostra para todas as 12 cavidades do chip para identificar a espécie de peixe das amostras de DNA testadas.

Abra o programa decodificador de RFLP clicando em arquivo. Em seguida, abra o arquivo XAD. A caixa de diálogo abrir será exibida.

Agora selecione o arquivo XAD para o chip de DNA utilizado. E clique em abrir para visualizar uma lista das amostras carregadas no chip. Selecione os três digestos correspondentes à primeira amostra de DNA.

Na coluna enzima, especifique as enzimas de restrição que foram utilizadas no campo denominado altura mínima do pico como porcentagem do marcador inferior. O valor padrão é 10%, se necessário. Esse valor pode ser reduzido para identificar picos pequenos que foram ignorados ou aumentado para descartar picos resultantes de ruídos não específicos no eletroferograma.

Após realizar ajustes no valor da altura mínima do pico, clique em reintegrar. Agora, clique em calcular na parte inferior da caixa de diálogo. Os dados de comprimento do fragmento obtidos pela corrida no bioanalisador preencherão os campos do software.

Em seguida, na lista suspensa de pontuação no canto superior esquerdo da tela, selecione dados. Se a amostra de peixe consistir em uma única espécie de peixe ou uma mistura, caso a amostra possa consistir em uma mistura, a tabela na parte inferior da tela identificada como lista de pontuação combinada. As melhores correspondências de espécies com base nos resultados das três reações de digestão.

As correspondências perfeitas com pontuação igual a um são destacadas em verde. As correspondências aproximadas são destacadas em amarelo na parte superior da tela. O valor de corte inferior designa o tamanho mínimo do fragmento utilizado na análise, e o valor de tolerância de correspondência determina o quão próximo em comprimento um fragmento deve estar do fragmento previsto para ser considerado uma correspondência.

Os valores apresentados são as configurações padrão e podem ser ajustados. Repita esses passos para a análise das amostras de DNA restantes na ponta. Amostras de DNA de quatro espécies diferentes de peixes foram isoladas, amplificadas e digeridas utilizando o método descrito neste vídeo.

Um gel de bioanalisador mostrando as amostras de digestão por enzima de restrição é exibido aqui utilizando o Bioanalisador Agilent e o decodificador RFLP. Padrões de dobramento de software são usados para identificar os peixes aqui. A primeira amostra é corretamente identificada como truta, a segunda como atum, a terceira como peixe-pedra.

E a última amostra como bacalhau específico. Acabamos de mostrar como realizar a identificação de espécies de peixes baseada em DNA utilizando o método P-C-R-R-F-L-P da Agilent. Ao realizar este procedimento, é importante evitar a contaminação cruzada das amostras, já que o método é muito sensível.

Pronto. Agora você sabe como identificar rapidamente, facilmente e com precisão as espécies de peixes presentes em suas amostras. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.