Microscopia óptica de dispersão com base em filtros Gabor Two-Dimensional

Neste vídeo, a microscopia de dispersão óptica é utilizada para quantificar a fragmentação mitocondrial durante a apoptose. Embora a microscopia de dispersão óptica normalmente não exija fluorescência neste protocolo, imagens fluorescentes serão adquiridas para fins de validação. Após a configuração do sistema de imagem, as células são marcadas com MIT tracker green e tratadas com stor sporin para induzir a apoptose.

Dados ópticos são adquiridos para detectar alterações na orientação de organelas celulares dentro de duas horas. O início da fragmentação mitocondrial pode ser medido usando os dados espalhados ópticos, que mostram uma diminuição no grau de orientação de partículas subcelulares. Os dados são então validados correlacionando os dados espalhados ópticos com as regiões fluorescentes que contêm mitocôndrias.

Olá, sou Nada Bustani do Laboratório de Bio-Óptica do Departamento de Engenharia Biomédica da Rutgers University. Sou Rob Pak do Laboratório de Bio-Óptica, e eu sou Deen, também do Bio Lab. Hoje vamos mostrar um procedimento para quantificar dinâmicas morfológicas subcelulares usando um método que não depende de corantes fluorescentes.

Utilizamos esta técnica em nosso laboratório para estudar alterações dinâmicas na estrutura subcelular durante a apoptose ou morte celular programada. Então, vamos começar. Inicie este procedimento esterilizando as mãos com luvas usando etanol a 70%.

Em seguida, coloque uma solução estoque preparada de 100 nanomolar de miot tracker green e o meio de cultura de células BAEC pré-aquecido na câmara de fluxo laminar com a luz desligada e esterilize todas as superfícies. A seguir, posicione uma placa de cultura de seis poços com células semeadas sobre lamínulas sob a câmara de fluxo laminar. Utilizando uma pipeta de Pasteur conectada a uma linha de vácuo.

Remova o meio celular dos poços. Em seguida, adicione imediatamente dois mililitros do meio marcado a cada poço para marcar as mitocôndrias celulares. Cubra a placa de cultura de tecidos para evitar exposição à luz ambiente direta e coloque rapidamente as células de volta ao incubador.

Incubar por 45 minutos a 37 graus Celsius enquanto as células incubam. Prepare primeiro a configuração óptica ligando o suporte de arco de mercúrio. Em seguida, ligue os computadores, câmeras do microscópio e laser, e conecte o dispositivo digital de microespelhos ou DMD no difusor giratório.

Em seguida, olhe através da ocular do microscópio para verificar se o lançamento óptico está alinhado. O campo de visão deve ser intensamente iluminado pela luz do laser. Para carregar a amostra, coloque uma ou duas pequenas gotas de óleo de imersão sobre uma objetiva de imersão a óleo de 63 x enquanto ela estiver totalmente para baixo.

Em seguida, coloque na platina uma lâmina contendo uma grade de linhas em intervalos regulares de 10 micrômetros chamada gradi e levante a objetiva até que o óleo a capture em foco. Depois, foque a borda hexagonal do diafragma do condensador. Pare quando estiver alinhada com a iluminação de Kohler central.

A borda hexagonal deve ser centralizada no ocular e focada com nitidez. Em seguida, utilizando os botões de posição do diafragma de campo, centralize o condensador e o diafragma de campo sobre o campo de visão. Inicie o laboratório de IP e insira as configurações para operar a câmera.

Confirme se a câmera está configurada no modo de transferência de quadro. Execute o comando de aquisição de foco para iniciar a visualização ao vivo. Em seguida, defina o prefixo do índice e o local do arquivo onde as imagens serão salvas.

Em seguida, inicie a imagem RS. Defina as configurações para operar a câmera cool snap. O modo de clocking deve ser definido como normal.

Inicie o software DMD. Coloque o diafragma de campo escuro no menu de script. Em seguida, clique em carregar e redefinir.

Para executar o script manualmente, defina a barra optiv do microscópio na janela de visualização para LSM. Isso enviará a imagem através do DMD na óptica alinhada. Projetando a imagem de campo escuro no CCD da câmera Cascade five 12.

A imagem de campo escuro deve aparecer na pré-visualização ao vivo no IP Lab. Se necessário, foque a imagem na pré-visualização ao vivo. Ajuste o tempo de exposição o suficiente para garantir pelo menos 10.000 contagens de sinal na imagem.

Em seguida, tire uma imagem do campo de visão utilizando o comando adquirir único após a aquisição. Use o comando salvar como indexado para salvar a imagem no disco. A imagem do GTI mede o tamanho do campo de visão.

Agora mova a amostra GTI para além do campo de visão, de modo que apenas o fundo seja visível. Capture uma imagem de fundo do campo com um tempo de exposição suficiente para adquirir pelo menos 5.000 contagens. Esta imagem auxiliará na subtração do fundo das imagens não filtradas.

Agora, para adquirir imagens filtradas por Gabor do fundo, carregue o script do Banco de Filtros de Gabor no software de controle do DMD. Execute todo o script para armazenar os filtros na memória integrada do DMD. Isso pode levar alguns minutos após todo o script ter sido armazenado.

Utilize os marcadores de início e parada no software DMD para garantir que apenas um conjunto de filtros correspondente a um filtro tipo Gabor seja carregado por vez. Execute o script para adquirir imagens filtradas do fundo. A pré-visualização da imagem ao vivo deve mudar de campo escuro para a imagem filtrada.

Para esse filtro, abra o script de aquisição no IP Lab a partir do disco. Ajuste o tempo de exposição para garantir que sejam adquiridas pelo menos 2000 contagens. Enquanto o script DMD estiver em execução, cancele a visualização ao vivo no IP Lab e execute o script de aquisição.

Isso adquirirá automaticamente o índice e salvará a imagem filtrada no disco. Após a aquisição da primeira imagem, pare a execução do script no DMD. Exclua os comandos utilizados do script.

Em seguida, substitua os marcadores de início e fim no início e no final do próximo conjunto de filtros. Repita a aquisição no laboratório de IP até que todo o banco de filtros tenha sido utilizado e todas as imagens filtradas tenham sido adquiridas e salvas. Prepare-se para semear as células ligando um ferro de solda na bancada do laboratório e aquecendo o meio L 15 a 37 graus Celsius.

Monte uma estação de trabalho com um papel-toalha e uma toalha de limpeza Kim para absorver qualquer meio derramado e manter a área limpa. Prepare várias mechas rasgando e torcendo toalhas de limpeza Kim. As mechas serão usadas para puxar o fluido através da placa de células.

Em seguida, utilize o suporte metálico para amostras para montar um "sanduíche" celular. Use uma seringa para aplicar um filete fino de graxa de vácuo ao redor da periferia superior do orifício na placa metálica usinada, estendendo-se até cerca de metade do caminho até as extremidades das ranhuras em cada lado. Coloque suavemente uma lamínula limpa número um sobre a graxa.

Gire a placa e aplique a graxa ao redor do orifício. Apague as luzes do ambiente usando luvas de exame NI esterilizadas com etanol. Retire as células do incubador.

Remova a lamínula que será usada para o experimento da placa de seis poços. Seque cuidadosamente a lamínula. Em seguida, pressione a lamínula com o lado das células voltado para baixo sobre a placa metálica untada, cobrindo o orifício de visualização.

Colocar as células no interior da placa. Certifique-se de que não permaneçam bolsas de ar e de que a graxa tenha formado um selo impermeável para que o meio possa ser adicionado. Agora, vire a placa novamente e pipete 200 microlitros de cada vez.

Adicione o meio L 15 pré-aquecido ao sanduíche através do sulco entre a lamínula superior e a placa de metal até que o líquido quase alcance o sulco do outro lado. Em seguida, lave as células mantendo uma mecha no sulco oposto e pipetando adicionais 200 microlitros de meio no sanduíche. O meio fluirá de um lado para o outro à medida que a mecha remover o meio antigo.

Tenha cuidado para evitar a formação de bolhas no líquido durante este passo. Repita este processo duas a três vezes, utilizando um pavio novo para cada enxágue. Agora, inverta a placa mais uma vez, sustentando-a pelas bordas, de modo a aprisionar o líquido no reservatório da célula.

Mergulhe o ferro de solda no béquer com veap para derreter rapidamente uma pequena quantidade do veap, que então aderirá à ponta do ferro de solda. Usando a ponta do ferro de solda, aplique cuidadosamente o veap derretido ao redor das bordas da lamínula inferior. Continue mergulhando e aplicando ao longo de todo o perímetro da lamínula, selando-a à placa metálica.

Isso cria um bom selamento mecânico para que a lamínula não se solte da placa durante a observação. Remova qualquer resíduo da parte inferior. Limpe a superfície da lamínula enrolando um lenço de papel kim e utilizando-o para limpar a lamínula.

Deslize em um único movimento contínuo para garantir que a lamínula fique mais limpa no centro, onde será observada. Devolva a placa de seis poços ao incubador. Leve as células cultivadas ao laboratório de óptica e monte-as no objetivo.

Como antes, localize um campo de células com aparência saudável e adquira uma imagem em campo escuro do campo de visão. Em seguida, alinhe o microscópio em contraste de fase diferencial (DIC) e certifique-se de que os tempos de exposição são adequados. Adquira uma imagem DIC com uma câmera de cascata.

Nesta configuração, imagens fluorescentes são adquiridas usando a câmera cool SNAP enquanto o microscópio ainda está alinhado em DIC. Ajuste o VAR do microscópio para um x e a janela de visualização para 100% binocular e desvie a imagem da ocular para a câmera. Coloque um LED azul sobre o condensador para iluminar o campo.

Em seguida, visualize o campo de visão na imagem RSS e ajuste o foco fino. Se necessário, adquira uma imagem DIC e salve no disco. Observe como o campo de visão difere daquele obtido com a câmera em cascata.

Essas imagens precisarão ser registradas durante a fase de análise do experimento. Em seguida, posicione o cubo de filtro fluorescente e adquira uma imagem de fluorescência ativando brevemente a excitação da fluorescência por meio do obturador do microscópio, desligando-a imediatamente após a conclusão da aquisição. Para minimizar o fotodesvanecimento, salve a imagem de fluorescência no disco.

Para adquirir imagens filtradas, reinicie o microscópio para o campo e envie a luz através da porta LSM. Como antes, execute todo o script do banco de filtros de Gabor como anteriormente para concluir a aquisição de dados para um ponto temporal enquanto as células ainda estiverem na platina e sem perturbar o campo de visão. Utilize o método de capilaridade para substituir o meio L 15 comum pelo mesmo contendo uma solução de um micromolar de STS.

Durante o experimento, adicione meio adicional para evitar a secagem, pipetando o meio no sulco da placa de células sem removê-la da platina ou perturbar o campo de visão. Agora, repita esses passos para os pontos de tempo subsequentes até que o experimento seja concluído. Os dados coletados incluirão um grande número de imagens filtradas que deverão ser processadas para extrair os dados estruturais subcelulares.

Aqui são mostrados dois experimentos de exemplo. Esta figura apresenta imagens sequenciais de uma amostra de alga diatomácea marinha. As estruturas orientadas são claramente visíveis.

Na imagem em campo escuro. As imagens com filtro óptico, rotuladas de cinco igual a zero graus até cinco igual a 160 graus, são mostradas ao lado da imagem sem filtro da amostra. Para comparação, o conjunto de nove imagens filtradas por Gabor da diatomácea foi processado pixel a pixel para determinar a orientação do objeto.

Em cada pixel, o sinal máximo foi dividido pelo sinal médio em função da orientação do filtro para fornecer um valor de razão de aspecto. Aqui, uma razão de aspecto próxima de um, indicada em azul, está presente em áreas nas quais não há um ângulo de resposta preferencial. Valores maiores, indicados em vermelho, indicam áreas nas quais há uma resposta com ângulo preferencial mais acentuada.

A intensidade e a significância do código da resposta total do filtro GABOR, a orientação do filtro, fornecendo o sinal máximo em cada pixel, corresponde à direção perpendicular à orientação do objeto subjacente. A orientação das partículas da subestrutura é codificada em um gráfico de setas, em que cada linha concorda estreitamente com a orientação local do objeto subjacente visível no campo escuro sem filtro. O gráfico de setas mostra a orientação dos objetos com intensidades de resposta superiores a 10% do valor máximo.

Essas imagens de campo escuro e com filtro óptico de um campo continham células endoteliais bovinas vivas; imagens filtradas foram subsequentemente adquiridas a cada 20 minutos durante um período de três horas após o tratamento com o indutor de apoptose stor sporin. Aqui, o mapa da razão de aspecto no painel superior e a imagem de fluorescência das mitocôndrias no painel inferior são mostrados como função do tempo. A tonalidade da cor representa o grau de orientação, como antes; esses gráficos temporais comparam a diminuição do grau de orientação da razão de aspecto das partículas em células endoteliais tratadas com s thoro sporin, sendo que os traços individuais representam gráficos temporais dentro de células individuais.

A orientação dos drop-ins é restrita às regiões das células que coincidem com as regiões fluorescentes. Agora, a validação frente à fluorescência foi obtida. Torna-se arquivável.

Assim, nos próximos experimentos, as medições mitocondriais podem ser realizadas omitindo as etapas de imagem de fluorescência e utilizando diretamente o método de dispersão óptica. Acabamos de mostrar como monitorar a fragmentação mitocondrial durante a apoptose usando assinaturas de dispersão de luz baseadas em filtros de Gabor. Ao realizar este procedimento, é importante ter um bom preparo do sistema e garantir que a configuração óptica esteja bem alinhada e calibrada.

Então, vamos dar sentido à observação e ao trabalho conjunto com experimentos de interface do usuário no CoLab.