MALDI preparação da amostra: o método de Camada Ultra Thin
29 de abril de 2007
Este vídeo demonstra a preparação de uma ultra-fina camada de matriz / analito para a análise de peptídeos e proteínas por Matrix Assisted Laser-ionização dessorção Espectrometria de Massa (MALDI-MS).
Bem-vindo ao tutorial do laboratório CHI sobre o método da camada ultrafina, que é particularmente útil para a determinação precisa da massa de proteínas. Devido à natureza sensível da espectrometria de massas, utilizamos apenas reagentes de grau HPLC, bem como luvas de látex ou nitrílica sem pó para limpar a placa. Enxágue alternadamente com metanol e água, e finalmente novamente com metanol.
Entre cada enxágue, remova suavemente o solvente em excesso usando papel para lentes. Você pode repetir essas etapas de lavagem quantas vezes forem necessárias para obter uma placa limpa. Após limpa e seca, a placa deve ser usada imediatamente.
Aplique e espalhe de 20 a 30 microlitros de solução de substrato em camada fina sobre a placa MALDI limpa. Aqui, utilizamos uma ponteira P dois 50 para espalhar uniformemente a solução, evitando riscar a placa. Conforme a camada fina seca, remova quaisquer gotículas de água remanescentes, se presentes, pressionando suavemente com um lenço de papel kim.
Em seguida, passe suavemente a placa com um movimento contínuo usando um lenço de papel Kim para formar adequadamente a camada fina. Por fim, limpe as bordas da placa para evitar contaminar o espectrômetro de massas. É fundamental testar a camada fina antes de aplicar sua amostra.
Se a mancha-teste demorar muito para secar, onde os cristais não são homogêneos, o problema pode estar na própria camada delgada ou na solução da matriz; limpe a placa, reaplique a camada delgada e refaça o teste. Ao aplicar as amostras na camada delgada, você não deve deixar que as manchas sequem completamente. Em vez disso, assim que a cristalização desacelerar e parar, remova o excesso de solvente.
Usando um aspirador a vácuo, a presença de contaminantes como sais e detergentes, bem como alta concentração do analito, pode interferir na cristalização. Uma diluição adicional da amostra pode melhorar a cristalização. Localize as Ants em proximidade próxima à amostra. Isso permitirá uma calibração pseudo-interna, na qual a placa é movida do ponto da amostra para o ponto de calibração.
Durante a aquisição da amostra, adicionar alguns disparos a laser do CAS ao espectro; essa abordagem garante uma calibração com maior precisão de massa do que a calibração externa isoladamente. É muito importante remover quaisquer contaminantes, como sal ou detergente, que possam interferir na ionização do analito. Para tanto, adicione gotas de ácido trifluoroacético a 0,1% em água grau HPLC, previamente resfriada em gelo, diretamente sobre os pontos.
Remova a solução de lavagem utilizando um aspirador a vácuo conforme mostrado aqui. Este método produz espectros excelentes tanto para proteínas de membrana quanto solúveis.
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Visão Geral
Este vídeo demonstra a preparação de uma camada ultrafina de matriz/análito para análise de peptídeos e proteínas por espectrometria de massas com ionização a laser assistida por matriz (MALDI-MS). O método é essencial para a determinação precisa da massa de proteínas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Espectrometria de Massas
- Análise de Proteínas
- Química Analítica
Antecedentes
- A espectrometria de massas é uma técnica sensível para analisar biomoléculas.
- A preparação da placa de amostra é crucial para resultados precisos.
- Recomendam-se reagentes de grau HPLC para a limpeza.
- Técnicas adequadas de manipulação e limpeza melhoram a qualidade da análise.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar o método da camada ultrafina para MALDI-MS.
- Garantir a determinação precisa da massa de proteínas.
- Fornecer um tutorial sobre as melhores práticas para preparação de amostras.
Métodos Utilizados
- Uso de reagentes de grau HPLC.
- Limpeza da placa com metanol e água.
- Remoção do solvente em excesso com papel para lentes.
- Uso imediato da placa limpa para análise.
Resultados Principais
- Demonstrou métodos eficazes de limpeza para a placa de amostra.
- Destacou a importância de usar materiais apropriados.
- Mostrou os passos de preparação para uma camada ultrafina.
- Forneceram informações sobre a manutenção da integridade da amostra.
Conclusões
- O método da camada ultrafina é essencial para uma espectrometria de massas precisa.
- Técnicas adequadas de limpeza e preparação são fundamentais.
- Seguir as melhores práticas pode melhorar significativamente os resultados da análise.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A determinação precisa da massa de proteínas é fundamental para a validação de alvos e a identificação de compostos iniciais na fase inicial de descoberta. O método de preparação de amostra MALDI em camada ultrafina melhora a qualidade dos dados ao aumentar a tolerância a impurezas e a uniformidade espacial, favorecendo uma avaliação confiável de compostos. Este método permite confiança preditiva na caracterização de proteínas, reduzindo a ambiguidade mecanicista na seleção de modelos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a determinação precisa da massa de proteínas, apoiando a investigação de hipóteses terapêuticas e a validação funcional de alvos.
- Valor Operacional: Oferece maior tolerância a sais e detergentes, reduzindo falsos negativos em amostras propensas a impurezas.
- Valor Preditivo: Melhora a resolução e a uniformidade espacial, aumentando a confiança na identidade da proteína e no seu estado de modificação.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Produz espectros de alta qualidade e reprodutíveis, essenciais para a padronização de ensaios e a consistência de leituras quantitativas.
- Valor Operacional: Utiliza etapas simples e robustas, compatíveis com ambientes de triagem de alto rendimento.
- Escalabilidade: Permite a preparação de placas de amostras validadas para fluxos de trabalho subsequentes, apoiando a reutilização da plataforma em diversos projetos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Permite a análise de proteínas membranares e solúveis, possibilitando a caracterização de sistemas relevantes para doenças.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Facilita a determinação precisa da massa de proteínas com amplas faixas de massa (até 380 kDa), auxiliando na otimização de compostos líderes.
- Alinhamento com Modelos Pré-clínicos: Aplicável a canais iônicos, transportadores e receptores, apoiando a validação de alvos em modelos fisiologicamente relevantes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método da camada ultrafina se insere no continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a identificação de compostos líderes e o perfil pré-clínico, permitindo análise confiável de proteínas em cada estágio.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao fornecer dados de massa exata para identificação e caracterização de proteínas.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos reprodutíveis que permitem avaliação confiável de compostos no desenvolvimento de ensaios.
- Análises: Gera espectros de massa de alta resolução com uniformidade espacial, melhorando a comparabilidade dos dados entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta à continuidade pré-clínica por meio de análises consistentes de massa proteica em diferentes tipos de amostras.
- Reutilização Empresarial: Representa uma capacidade padronizada e robusta de preparação de amostras aplicável a múltiplas classes de proteínas e projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na determinação da massa proteica, redução da ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e tolerância a contaminantes comuns, como sais e detergentes.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais eficazes de prosseguir/não prosseguir por meio de qualidade aprimorada dos dados, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco com base em dados confiáveis de caracterização proteica.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência no manuseio de amostras para espectrometria de massas e nos princípios da MALDI-MS.
- Requer acesso a reagentes de grau HPLC, aspirador a vácuo e placas compatíveis com MALDI.
- Exige procedimentos padronizados de limpeza e secagem para garantir a uniformidade da camada.
- Necessita adaptação para diferentes concentrações de analitos e matrizes de amostras.
- Limitado pela necessidade de uso imediato da placa após a limpeza para evitar recontaminação.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
2:05
Step 5: test of the thin layer
2:50
Step 6: sample application
3:47
Step 7: calibrant application
1:52
Step 4: preparation of the matrix solution
0:58
Step 3: making the thin layer substrate
0:20
Step 1: cleaning of the sample plate
4:20
Step 8: washing step
0:46
Step 2: preparation of the thin layer substrate solution
5:05
Step 9: acquisition of mass spectra
